"超大纳米盘技术：实现膜蛋白复合体结构与功能一体化研究的突破性平台"

本研究针对膜蛋白(MPs)在体外研究中难以维持天然膜环境的关键问题，开发了基于体内分裂内含子策略的环化纳米盘(cNDs)系统。通过将Paracoccus denitrificans复合物I(Pd-CI)与天然辅酶Q10(Q10)及替代氧化酶(AOX)共重构，首次实现了3.1?分辨率的结构解析与稳态催化功能的同步研究，为复杂膜蛋白系统的机制研究提供了创新平台。

　　

膜蛋白作为细胞生命活动的关键执行者，约占人类蛋白质编码基因的25%，更是超过60%药物作用的靶点。然而其疏水特性带来的研究难题，使得科学家们长期在"结构解析"与"功能研究"之间面临两难选择——传统纳米盘(NDs)尺寸限制导致无法同时容纳酶复合体与足量脂溶性底物，而线性膜支架蛋白(MSP)的不规则缠绕更会阻碍底物交换。这种困境在呼吸链复合物I(CI)的研究中尤为突出：虽然冷冻电镜(cryo-EM)已能解析其高分辨率结构，但常规NDs无法支持其与天然Q₁₀底物及辅助酶AOX的持续催化循环。

剑桥大学的研究人员突破性采用体内分裂内含子策略，成功构建直径达26nm的环化纳米盘(cNDs)系统。通过将Paracoccus denitrificans CI(Pd-CI)与Q₁₀共重构，不仅获得3.1?分辨率的冷冻电镜结构，更首次实现与Trypanosoma brucei来源AOX组成的最小呼吸链单元，在4-37℃宽温度范围内持续催化NADH:O₂氧化还原反应（最高活性达20.8±0.6 μmol NADH min^-1 mg^-1）。该成果发表于《Scientific Reports》，为膜蛋白结构与功能的整合研究树立了新范式。

关键技术包括：1) 采用分裂内含子系统在E.coli中生产环化膜支架蛋白cMSP26；2) 优化脂质与蛋白质摩尔比(1200:10:1)实现Pd-CI的高效重构；3) 冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合体结构；4) 纳米差示扫描荧光法(nano-DSF)评估蛋白稳定性；5) 光谱法监测NADH:APAD⁺和NADH:O₂氧化还原活性。

【制备与表征Pd-CI-cNDs】

通过尺寸排阻色谱(SEC)证实cMSP26可形成约650kDa的磷脂双层结构。当Pd-CI以1200:10:1（脂质:cMSP26:CI）比例重构时，SEC显示成功组装均一复合体，纳米DSF显示膜结构域熔解温度提高3℃，证实cNDs的稳定作用。

【Pd-CI在cNDs中的冷冻电镜分析】

获得3.1?分辨率结构显示，cNDs直径达26nm，磷脂双层面积是常规2N2-NDs的4倍，估算可容纳25-48个Q₁₀分子。与先前线性MSP形成的"开放"双分子层相比，cNDs呈现完美环化拓扑。

【cNDs中最小呼吸链的持续催化】

加入10μg/mL AOX后，系统在32℃展现最大活性(20.8±0.6 μmol min^-1 mg^-1)，且能被鱼藤酮类似物piericidin A完全抑制。温度实验显示4-25℃活性稳定，37℃时出现衰减，反映温度对酶稳定性的影响。

【AOX与Pd-CI-cNDs的结合模型】

基于T.brucei AOX晶体结构(PDB-3W54)的对接显示，cNDs双层膜可同时容纳1个Pd-CI与4个AOX二聚体或2个四聚体，为电子传递提供充分空间。

这项研究开创性地证明，cNDs系统能完美协调膜蛋白研究中长期存在的"分辨率"与"功能性"矛盾。其核心价值体现在：1) 尺寸优势允许同时容纳多个膜蛋白与足量脂溶性底物；2) 共价环化特性赋予卓越的pH/温度/离子强度耐受性；3) 模块化设计可拓展至哺乳动物CI等更大复合体（牛心CI活性达17.1±0.6 μmol min^-1 mg^-1）。该技术平台为解析膜蛋白动态催化机制、药物靶点筛选及人工呼吸链设计提供了通用解决方案，将推动从基础研究到生物工程应用的跨越发展。