活体荧光原位杂交技术在土壤微生物组中的应用评估：突破难培养微生物的壁垒

针对土壤微生物难培养的问题，研究人员通过Live-FISH（活体荧光原位杂交）结合PMA-qPCR和流式细胞术，评估了该技术对土壤微生物存活率的影响。结果显示，Bacillota和Planctomycetota表现出较强耐受性，而Acidobacteriota则显著敏感。该研究为靶向分选和培养土壤稀有微生物提供了新思路，对挖掘微生物资源具有重要意义。

土壤是地球上最复杂的生态系统之一，蕴藏着超过99%尚未被培养的微生物资源。这些微生物在碳氮循环、抗生素合成和植物健康中发挥关键作用，但传统培养方法难以突破其生理壁垒。近年来，活体荧光原位杂交（Live-FISH）技术因其能在保持细胞活性的同时实现特异性标记而备受关注，但其在土壤微生物中的应用效果尚不明确。

丹麦技术大学（Technical University of Denmark）的Iuliana Nita团队在《Soil Security》发表研究，首次系统评估了Live-FISH对温带表层土壤微生物存活率的影响。通过结合PMA（碘化丙啶单氮唑）活性qPCR、流式细胞术和高通量测序，研究人员揭示了该技术的适用性边界及其分类群特异性效应。

研究采用BTN80法从丹麦Dyrehaven森林土壤中提取微生物，通过优化离心速度和缓冲液条件实施Live-FISH处理。关键技术包括：1）PMA-qPCR区分活/死细胞DNA；2）流式细胞术结合PI/DAPI双染色定量细胞完整性；3）16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序分析群落结构变化；4）四种培养基（M269、R2A等）评估可培养菌落变化。

3.1 Live-FISH对活细胞丰度的影响

数据显示，土壤提取使16S rRNA基因拷贝数降低2个数量级（9.6→7.6 log），而Live-FISH进一步使活细胞减少82%。流式结果证实活细胞比例从39%降至3.7%，且不同培养基的CFUs下降程度差异显著，其中酸性培养基M269的菌落数锐减99%。

3.2 分类群特异性存活差异

群落分析发现Bacillota和Planctomycetota在处理后相对丰度显著增加（分别达32.4%和29.7%），而Acidobacteriota的绝对丰度暴跌5个数量级。501个ASVs（扩增子序列变体）在全程保持活性，暗示其具备技术耐受性。

3.3 可标记类群的鉴定

Planctomycetota成员如Gemmata obscuriglobus经PLA886探针标记后，荧光显微和流式检测均显示良好信号保留。值得注意的是，优势存活类群包含多个未培养的Isosphaerales和Gemmatales菌株，其独特的细胞包膜结构可能增强抗逆性。

3.4 Acidobacteriota存活瓶颈解析

以Acidobacterium capsulatum为模型发现，杂交缓冲液中的35%甲酰胺和0.01% SDS是导致其死亡的关键因素。优化方案虽提高存活率，但牺牲了标记特异性。

该研究证实Live-FISH在土壤微生物应用中存在显著分类群偏好性：Bacillota（芽孢杆菌门）依靠孢子形成、Planctomycetota（浮霉菌门）凭借特殊细胞结构展现出技术优势，而Acidobacteriota（酸杆菌门）则因膜系统脆弱难以存活。这一发现为后续技术改良指明方向——针对敏感类群需开发温和的渗透与杂交条件。从生态学视角看，研究首次系统揭示了土壤微生物对分子标记技术的响应规律，为突破"微生物暗物质"培养瓶颈提供了实验依据。尤其对Planctomycetota的成功标记，为探索其未被描述的次级代谢潜能开辟了新途径。未来通过耦合微流控单细胞分选等技术，或能实现稀有微生物资源的定向挖掘。