裂解条件对碱性标准彗星试验及Fpg修饰体内彗星试验的影响机制研究

【编辑推荐】本研究通过调控裂解时间（0 min至1周）和pH（7 vs 10），系统评估了裂解条件对体内彗星试验（Comet Assay）检测DNA链断裂（SBs）和Fpg敏感位点的影响，揭示了长期裂解导致甲基甲磺酸盐（MMS）处理样本DNA迁移率升高的现象，为标准化基因毒性检测方案提供了关键实验依据。

　　

Highlight

裂解条件对体内标准彗星试验的影响

图1展示了口服200 mg/kg MMS或生理盐水的动物实验结果。当使用pH 10的裂解缓冲液时，从0分钟（无裂解）到1周的裂解时长中，48小时、72小时和1周时间点的冻存样本显示：与阴性对照相比，MMS处理组的DNA尾迹百分比（% DNA in tail）显著增加（p<0.05）。值得注意的是，0分钟至过夜裂解的数据来自新鲜样本，而更长裂解时长的数据来自冻存样本。

讨论

传统观点认为彗星试验中裂解步骤只要持续至少1小时（Collins, 2015）就无关紧要，研究者常采用过夜裂解以分割实验流程。OECD《体内哺乳动物碱性彗星试验指南》仅要求裂解时间保持恒定（≥1小时或过夜），但本研究证明：

1. 标准试验中，常用裂解时长（1小时/过夜/24小时）结果无显著差异，甚至省略裂解步骤仍可获得类似数据；

2. 超长裂解（>48小时）会导致MMS处理动物的DNA迁移率升高；

3. Fpg修饰试验中，酶孵育前必须进行至少5分钟裂解以暴露敏感位点；

4. MMS诱导损伤的检测具有时间和pH依赖性，而KBrO₃损伤则无此特性。

结论

本研究首次在监管机构采纳的体内彗星试验中验证了裂解条件的影响：标准版本对裂解时长不敏感，但Fpg修饰版本需至少5分钟裂解。中性pH可能轻微增加DNA尾迹百分比，而长期裂解（如1周）会放大MMS诱导损伤的信号。这些发现为优化基因毒性评估方案提供了重要参数。