数字PCR技术精准定量微卫星DNA双链断裂：为基因治疗与疾病诊断提供新工具

本研究针对重复序列中DNA双链断裂(DSB)定量难题，开发了基于数字PCR(dPCR)的高灵敏度检测方法。研究人员通过比较Southern blot、DSB-PCR、DSB-qPCR和dPCR四种技术，证明dPCR在CTG三核苷酸重复序列的DSB定量中具有显著优势，为微卫星扩展疾病机制研究和基因治疗开发提供了可靠工具。

　　

在基因组稳定性研究中，DNA双链断裂(DSB)如同潜伏的"分子地雷"，尤其当这些断裂发生在富含重复序列的脆性位点时，可能引发癌症、肌强直性营养不良等重大疾病。然而，传统检测方法在定量重复序列区域的DSB时面临巨大挑战——这些区域容易形成复杂的非B型DNA结构，就像打结的绳子般阻碍分子工具的准确读取。法国巴斯德研究所(Institut Pasteur, Paris)的Cécile Palao团队在《Biology Methods and Protocols》发表的研究，开发了一种突破性的数字PCR(dPCR)检测方案，为解开这个分子诊断难题提供了金钥匙。

研究人员采用四种技术路线系统比较：Southern blot通过上下游探针检测断裂末端，DSB-PCR通过末端转移酶介导的polyC加尾进行定性检测，DSB-qPCR结合荧光定量建立标准曲线，以及新兴的dPCR通过微滴分区实现绝对定量。实验使用含有80个CTG重复序列的酿酒酵母模型，通过TetOFF系统调控TALEN核酸酶诱导特定位点断裂。

Southern blot定量重组中间体

通过EcoRV酶切和双探针杂交，成功捕获到5'端收缩形成的拖尾现象和3'端800bp的特征条带。Image Lab软件分析显示，该方法能区分完整等位基因(2kb)、收缩等位基因(1.8kb)和断裂末端，但对低丰度DSB灵敏度有限。

DSB-PCR的定性检测

基于Telo-PCR原理开发的DSB-PCR方法，通过G18/VMS14引物对扩增polyC加尾的断裂末端，在2%琼脂糖凝胶上产生500bp产物。虽然操作简便，但仅能提供"有/无"的二元判断，无法满足精确量化需求。

DSB-qPCR的定量尝试

优化发现SYBR Green浓度显著影响结果——0.3x浓度下获得单峰熔解曲线，但标准曲线线性较差(R2=0.869)。该方法还严格依赖DNA上样量一致性，0.15ng/μL的低浓度进一步限制了检测精度。

dPCR的突破性表现

Stilla Technologies的Sapphire芯片将样本分割为25,000个微滴，通过EvaGreen(蓝通道)检测完整CTG重复序列，HEX探针(绿通道)定量内参基因JEM1。Crystal Miner软件分析显示：

• 蓝通道双群体：高位点对应JEM1(208.1 copies/μL)，低位点对应完整CTG(135.2 copies/μL)

• 与Southern blot结果高度吻合(34.6% vs 31.2%；6.3% vs 7.8%)

• 检测下限达6.3%，无需标准曲线且单日完成

这项研究确立了dPCR在重复序列DSB定量中的金标准地位，其优势体现在三个方面：首先，克服了非B型DNA结构对PCR扩增的干扰，为脆性位点研究提供可靠工具；其次，简化了传统Southern blot的繁琐流程，将检测周期从数天缩短至单日；最后，高灵敏度特性使其在基因治疗疗效监测、早期癌症筛查等场景具有转化潜力。研究人员特别指出，该方法可适配CRISPR-Cas9等其他核酸酶系统，为拓展至人类细胞研究奠定了基础。正如作者强调的，这项技术突破"如同为基因组不稳定性的研究装上了高精度显微镜"，将推动从基础机制到临床应用的转化研究。