综述：冷冻电镜样品制备的冷静与突破：技术进展与应用

这篇综述系统总结了冷冻电镜（cryo-EM）样品制备领域的最新进展，重点介绍了冷冻聚焦离子束铣削（cryo-FIB）、亲和网格（affinity grids）、细胞微图案化（micropatterning）和晶圆法（Waffle Method）等关键技术如何突破生物样本（如细胞和组织）的高分辨率结构分析瓶颈，为原位冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和单颗粒分析（SPA）提供更高效、可重复的解决方案。

　　

冷冻电镜样品制备的冷静与突破：技术进展与应用

引言

冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为结构生物学领域的革命性工具，能够以近原子分辨率解析天然状态下的生物大分子结构。然而，高质量样品的制备始终是制约其发展的关键瓶颈。从纯化蛋白质到细胞和组织样本，如何实现均匀分布、避免空气-水界面干扰，并保持动态结构完整性，是技术突破的核心方向。

重新设计电镜载网

传统电镜载网（EM grids）以铜或金为基底，覆盖多孔非晶碳膜，但碳膜易产生电荷积累和辐照变形。近年来，全金载网（如HexAuFoil）通过优化孔径与厚度比，将电子束诱导的样本移动降至1 ?以下，实现了DPS蛋白1.9 ?的超高分辨率解析。此外，石墨烯修饰的亲和网格（dual-affinity graphene）能特异性锚定目标蛋白，直接从裂解液中富集低丰度复合物，实现“载网上纯化”。

细胞外基质与微图案化技术

通过聚乙二醇（PEG）光刻和细胞外基质（ECM）蛋白图案化，研究者能在电镜载网上精确控制细胞分布。例如，人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的神经元和心肌细胞可被定向排列为X形或矩形，便于冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削定位。近期开发的纳米纤维载网（electrospun gelatin fibers）模拟了体内ECM的纳米拓扑结构，为研究细胞-基质相互作用提供了仿生平台。

喷雾辅助与时间分辨技术

传统 plunge freezing 易导致样本分布不均和瞬态结构丢失。新兴的喷雾辅助技术（如ESI-cryoPrep）通过电喷雾电离生成带电液滴，避免吸样步骤；而机器人系统Chameleon可实现毫秒级混合与冷冻，成功捕获钙门控钾通道的中间构象。在细胞层面，微流控混合与气动喷嘴技术（如mix-and-inject）能以25 ms时间分辨率解析细菌刺激后的结构变化。

冷冻聚焦离子束的进阶应用

冷冻等离子体聚焦离子束（cryo-PFIB）采用氙或氧等离子体替代传统镓离子束，铣削效率提升10倍，并减少表面损伤。例如，阿尔茨海默病脑组织切片经甘油保护剂处理后，通过cryo-PFIB制备的薄片首次揭示了病理相关纳米结构。晶圆法（Waffle Method）则通过高压冷冻（HPF）将样本封装于载网方格内，单日可制备16片铣削区域，面积达2800 μm²，显著提升通量。

展望

从原子尺度蛋白质到组织病理样本，冷冻电镜样品制备技术的创新正推动结构生物学迈向更复杂的生理和病理场景。未来，自动化铣削、时间分辨冷冻与多模态关联成像的融合，将进一步解开生命活动的动态分子密码。