优化枯草芽孢杆菌中酵母信息素异源表达的信号肽工具箱开发与应用

为解决工业生物技术中蛋白分泌效率低且缺乏可靠预测工具的问题，研究人员开发了包含74种Sec分泌系统信号肽(SP)的模块化工具箱，通过构建可替换启动子/SP/目的蛋白(POI)的评估载体，成功实现酵母α-和P-信息素在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的高效分泌，最高产量分别达8 nM和43 nM，为工业酶生产提供了标准化筛选平台。

　　

在工业生物技术领域，高效分泌异源蛋白是降低下游处理成本的关键。然而，目前缺乏可靠的计算工具预测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中信号肽(SP)与目的蛋白(POI)的最佳组合，导致蛋白分泌效率低下。尤其对于酵母信息素这类小分子肽（α-信息素仅13个氨基酸，P-信息素23个氨基酸），其原核表达尚未见报道，严重制约了跨物种细胞通讯等创新应用的开发。

针对这一技术瓶颈，德国德累斯顿工业大学(TUD Dresden University of Technology)的Tomislav Volo?en团队在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》发表研究，开发了包含74种天然SP的模块化工具箱。研究人员首先构建了可快速替换启动子、SP和POI的评估载体pBS1C-P_xylA-[P_lacI-RFP-lacZα]，通过三色菌落筛选简化克隆流程。为验证系统效能，选择酿酒酵母(S. cerevisiae)α-信息素和裂殖酵母(S. pombe)P-信息素作为模型POI，设计三种密码子优化方案（最高频、稳健型和协调型）。通过多模板PCR扩增SP混合库，结合间接ELISA筛选，最终鉴定出8个有效分泌P-信息素的SP（如YbxI、FliZ）和3个分泌α-信息素的SP（如YfkD）。

关键技术包括：1）基于BioBrick标准的模块化载体构建；2）抗生素诱导型启动子P_liaI调控系统；3）蛋白酶缺陷株WB800N（缺失8种胞外蛋白酶）宿主优化；4）四参数剂量反应曲线定量ELISA检测。

研究结果显示：

1. 评估载体构建：成功建立含双报告基因（RFP/lacZα）的三色筛选系统，SP与POI通过AgeI/NgoMIV位点实现快速替换。

2. 信号肽筛选：在74个SP中，YbxI使P-信息素分泌量最高（43 nM），而α-信息素最高产量仅8 nM（YfkD介导），揭示小肽分泌更具挑战性。

3. 表达优化：采用bacitracin诱导P_liaI启动子时，100 μg/mL诱导1小时效果最佳；6%接种量可提升产量3倍。

4. 蛋白酶影响：WB800N菌株的P-信息素产量显著高于野生型（p<0.0001），证实蛋白酶降解是限制因素。

讨论部分指出，该SP工具箱的创新性在于：1）首次实现酵母信息素在B. subtilis的分泌；2）标准化流程可扩展至其他POI筛选；3）为缺乏SP预测工具的领域提供实验解决方案。尽管α-信息素产量较低（可能因其非折叠结构易被蛋白酶识别），但研究证实Sec分泌系统（而非TAT途径）适用于小肽分泌。未来通过构建"miniBacillus"（缺失36%基因组）等超级蛋白酶缺陷株，或可进一步提升产量。

这项工作不仅为工业酶生产提供了标准化筛选平台，更为设计细菌-真核生物跨界通讯系统奠定了基础，展现出在合成生物学和白色生物技术中的广泛应用前景。