果蝇隐花色素中黄素离子化与质子化状态调控光激活与恢复的分子机制

本研究针对果蝇隐花色素(dCry)光激活机制的核心问题，通过光谱学、分子动力学模拟和细胞实验，揭示了黄素辅因子(FAD)的离子化状态(asq/FAD●-与hq/FADH-)通过静电排斥触发C端尾(CTT)释放的关键机制，发现侧隧道介导的质子转移调控中性半醌(nsq/FADH●)形成比例，提出His378作为质子拦截器协调光信号传导与恢复的动态平衡，为理解I型动物隐花色素的光敏机制提供新范式。

　　

在生物钟调控的精密网络中，隐花色素作为蓝光受体扮演着"光敏开关"的角色。然而长期以来，果蝇隐花色素(dCry)如何通过黄素辅因子的化学状态变化触发信号传导，以及为何其光激活模式与同源的光解酶存在显著差异，始终是未解之谜。更令人困惑的是，早期研究对His378质子化作用与pH值影响机制存在根本性争议，这些认知缺口严重阻碍了对动物光敏受体的精确调控机制的解析。

中国科学院的研究团队通过多学科交叉方法，在《Communications Chemistry》发表的研究破解了这一难题。研究采用改进的有限蛋白酶解法监测CTT释放动态，结合时间分辨光谱分析FAD氧化还原状态，通过分子动力学模拟揭示质子转移通道特征，并利用果蝇S2细胞系统验证蛋白稳定性。样本来源于重组表达的dCry及其突变体蛋白。

Trypsin cleavage at Arg430 is a good indicator of CTT release

开发新型蛋白酶解检测法，发现Arg430切割强度与asq形成呈正相关，确立其作为CTT释放的定量指标。光照下dCry在pH7.5时主要形成asq（吸收峰380nm/580nm），伴随15kDa特征片段d生成，暗适应100分钟后氧化恢复原始状态。

CTT release was suppressed in the nsq state but promoted in both the asq and hq states

结构比对揭示Cys416空间位阻阻碍质子化，构建C416N突变体证实：asq态(k_asqox=0.21 min^-1)和hq态(k_hqox=0.03 min^-1)均能触发CTT释放，而nsq态(k_nsqox=0.001 min^-1)则抑制该过程。L405E/C416N双突变验证Glu405可加速质子转移至nsq态。

pH-dependent photoreduction, CTT release, and oxidation of wild-type dCry

关键发现：pH6.5时nsq占比升高(600nm/647nm特征峰)抑制CTT释放，pH9.0时纯asq态促进释放，推翻"His378质子化驱动激活"的传统认知。nsq比例与氧化速率呈正相关(k_asqox从pH9.0的0.06 min^-1增至pH7.5的0.17 min^-1)，揭示其促进暗恢复的生理意义。

The mutants in CTT minimize nsq formation during photoreduction

CTT缺失突变体(dCT)及Trp536突变体形成纯asq态，分子动力学显示其侧隧道入口变窄(α8螺旋内移3.2?)，曲率降低导致质子转移受阻。这些突变体氧化速率减缓，解释自然选择保留完整CTT的进化优势。

His378 acts as a proton interceptor during photoreduction

结构解析发现侧隧道终止于His378所在结合口袋。H378D突变(负电荷)抑制nsq形成，H378A/K突变则增强质子化，证实该残基通过静电效应调控质子流向，平衡信号激活(k_pr1=0.05 s^-1)与恢复动力学。

这项研究建立了dCry光激活的"电荷-构象"双重调控模型：FAD的负电荷(asq/hq)通过排斥Phe534触发CTT释放，而构象弯曲增强该效应；侧隧道介导的质子流受His378调控，适度nsq形成加速暗恢复。这不仅解决了光受体领域长期争议，更为设计光控基因工具提供了关键靶点——通过改造质子转移通道可能精确调控光敏蛋白的响应动力学。发现的结构原理或可推广至哺乳动物CRY蛋白研究，为开发新型光遗传学工具奠定基础。