突破环状RNA技术瓶颈：基于完整自剪接内含子的高效环化新策略CIRC与PIET

本研究针对mRNA疗法面临的修饰成本高、半衰期短等瓶颈问题，开发了基于自剪接内含子第二步骤的RNA环化新技术CIRC与PIET。通过优化完整I/II型内含子应用体系，实现了12kb大片段RNA高效环化、无疤痕序列生成及简化纯化流程，成功表达427kDa抗肌萎缩蛋白，为基因治疗提供了全新平台。该成果发表于《Nature Communications》，标志着环状RNA技术取得重要突破。

　　

在生物医药领域，mRNA疗法因其在传染病疫苗、癌症免疫治疗等方面的突破性进展而备受瞩目。然而这一平台始终面临两大技术瓶颈：核苷酸修饰带来的高昂成本，以及线性mRNA在体内半衰期短的固有缺陷。环状RNA（circRNA）作为1976年发现的共价闭合单链环状分子，因其无需修饰的天然稳定性和持久蛋白表达能力，被视为下一代RNA药物的理想候选。但现有环化技术存在效率低、产物不纯、大片段环化困难等核心问题，严重制约了其临床应用。

为攻克这些技术壁垒，北京大学基因组编辑研究中心、昌平实验室联合Therorna公司的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。团队通过重新设计自剪接内含子的作用机制，开发出两项突破性技术：PIET（转剪接排列内含子-外显子）和CIRC（完整自剪接内含子环化系统）。其中CIRC技术通过利用完整I/II型内含子的第二剪接步骤，不仅实现了高达12kbRNA片段的成功环化，更在效率、纯度和反应条件等方面显著超越传统PIE方法。

研究采用的关键技术包括：1）基于T7聚合酶的体外转录系统优化；2）通过cGMP抑制大片段转录过程中的内含子提前剪接；3）RNase R消化与oligo(dT)磁珠纯化联用技术；4）qPCR定量检测环化接头；5）流式细胞术评估蛋白表达效率。这些方法的组合应用为环状RNA生产建立了标准化流程。

【PIET技术实现两步剪接解耦】

研究人员首先突破传统思维，发现I型内含子的第二步转酯化反应可独立完成环化。通过将5'-内含子与中间体分离表达再混合，成功构建双组分PIET系统。实验证实该体系无需GTP参与，仅需Mg²⁺和5'-内含子即可完成环化，转染293T细胞后EGFP表达量显著高于线性前体。

【CIRC技术突破效率极限】

基于PIET的发现，团队进一步开发出更高效的CIRC技术。通过系统优化外显子长度（最小16nt）、同源臂长度（19-50nt平衡效率与翻译）和间隔序列，使环化效率在55°C、pH6.8条件下接近100%。值得注意的是，CIRC在0.2mM Mg²⁺下即可工作，远低于PIE所需的3.2mM，大幅降低了RNA水解风险。

【跨物种内含子资源挖掘】

研究团队从数据库筛选多种I/II型内含子进行测试，包括来自嗜热四膜虫（Tet）、鱼腥藻（Ana）等的I型内含子，以及不含ORF的II型内含子。结果显示绝大多数测试内含子均可介导有效环化，为后续筛选高性能内含子奠定基础。其中Ana内含子保持最高效率，成为后续比较研究的基准。

【性能全面超越PIE方法】

在四组不同负载（EGFP、Gluc、Fluc、POLR2A）的对比实验中，CIRC的环化效率均显著优于PIE。特别在产物纯度方面，CIRC产生的单体circRNA回收率更高，且更少形成串联体。在温和反应条件下（4mM Mg²⁺、pH6.5），CIRC的环化速率更快，16小时IVT反应仅需1小时即可达到更高效率。

【突破尺寸限制创造纪录】

通过优化IVT缓冲液和添加cGMP抑制剂，团队成功环化了编码全长人类抗肌萎缩蛋白（12,206nt）的RNA，Western blot检测到427kDa蛋白表达。这是目前报道的最大功能性circRNA，突破了既往9kb的技术天花板。延伸实验显示该系统甚至可环化16.8kbRNA，虽未检测到蛋白表达，但证实了技术的扩展潜力。

【无疤痕环化与免疫原性控制】

CIRC通过精确设计分裂位点（如CVB3 IRES中的UCU/AA位点）实现完全无外源序列的circRNA生产。免疫原性测试显示，无论是否含疤痕序列，circRNA均保持低免疫原性特征，其中circPOLR2A与T4连接酶产物相当，证实了技术的治疗安全性。

【创新纯化策略】

针对副产物去除难题，团队开发了两种高效纯化方案：1）利用CIRC前体3'端结构简单特性，增强RNase R消化效率；2）在内含子P6域插入poly(A)序列，实现oligo(dT)柱亲和纯化。后者仅需单次过柱即可去除90%以上杂质，为规模化生产提供可能。

这项研究通过重新设计RNA环化的生化路径，建立了更高效、更灵活的circRNA技术平台。其创新价值主要体现在三个方面：首先，CIRC技术突破了大片段RNA环化的技术瓶颈，使表达超大蛋白（如抗肌萎缩蛋白）成为可能；其次，无疤痕环化能力为研究内源性circRNA功能提供精准工具；最后，简化纯化流程大幅降低生产成本。这些突破不仅推动circRNA向临床转化迈出关键一步，更为遗传病治疗、疫苗开发等领域开辟了新路径。正如研究者Yong Shen和Wensheng Wei在讨论中指出，该技术的真正潜力可能在于与化学修饰、特殊帽结构的协同创新，这将是未来研究的重要方向。