单分子镊子技术揭示膜蛋白二聚化隐藏路径：从中间态解析到药物靶向调控

本研究通过开发单分子镊子平台，首次实现对跨膜(TM)蛋白二聚化过程中"扩散后阶段"的动态追踪，揭示隐藏中间态(I1/I2)及能量景观特征。结合分子动力学(MD)模拟，阐明TMHC2二聚体通过DTM-edge→DTM-core→Dsoluble的层级组装机制，为靶向TM二聚化的抗癌药物设计提供单分子分辨率研究工具。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，跨膜(TM)蛋白的二聚化过程犹如分子级别的"握手礼"，控制着生长因子信号传导、细胞命运决定等关键生理功能。然而这个看似简单的"单体-二聚体"两态转变模型，可能掩盖了膜蛋白在脂质双层中复杂的组装密码。传统研究手段如荧光共振能量转移(FRET)和分子嵌合体分析虽能捕捉二聚化终点，却难以解析扩散接触后的动态过程——而这正是抗癌药物如EGFR抑制剂的作用靶点。这种认知空白使得针对TM二聚化的药物开发长期处于"盲人摸象"状态。

为破解这一难题，Victor W. Sadongo等研究者构建了革命性的单分子镊子平台，以设计的TM同源二聚体TMHC2为模型，通过精妙的分子工程策略实现二聚体循环解离-重组。该系统核心是弹性蛋白样多肽(ELP)连接器，配合正交偶联化学(SpyCatcher-SpyTag/SnoopCatcher-SnoopTag)，使单个TM二聚体能在脂质双分子层(以双锥形胶束形式存在)中经受反复力学测试。研究采用两种模式：力梯度模式(force-ramp)绘制整体解离曲线，力钳模式(force-clamp)捕捉瞬态中间态。结合全原子分子动力学(AAMD)和粗粒化分子动力学(CGMD)模拟，首次完整描绘出TM蛋白二聚化的动态全景图。

关键技术包括：1) 构建三种长度ELP连接器(75/111/146aa)的TMHC2复合体；2) 磁镊系统实现pN级力控(1-50pN)；3) 隐马尔可夫模型(HMM)解析中间态跃迁；4) 基于Bell-Evans模型的能量景观重建；5) 靶向肽(7-13aa)干扰实验验证功能位点。

中间态的结构解码

力钳实验发现30%二聚体解离呈现阶梯式特征，经HMM分析鉴定出两个中间态(I₁和I₂)。通过二硫键突变体排除单体内解折叠干扰，确认中间态源于单体间相互作用。将解离过程标准化显示，I₁和I₂分别对应20%和80%二聚化程度。AAMD模拟结合残基相互作用网络生成器(RING)分析揭示：I₁对应0-2层(D_TM-edge)的氢键网络，I₂对应2-8层(D_TM-core)的范德华力密集区，而8-10层(D_soluble)的静电作用构成最后"锁扣"。

无外力下的主导路径

CGMD模拟80次独立运行显示，自由扩散后二聚化遵循0→10层的方向性组装，其中0-1层因强氢键能力成为成核位点。这种层级组装与单分子实验高度一致，证实技术平台捕获的是生理相关路径。

动力学与能量景观

通过Bell-Evans模型外推获得零力条件下各域转换速率：D_TM-core解离最慢(k_d,m,0=0.03s^-1)，成为限速步骤；而D_soluble结合需克服8.8k_BT能垒，是能量瓶颈。重构的能量景观显示，完整二聚体具有12.8k_BT的稳定性，主要来自D_TM-core的7.2k_BT贡献。

肽抑制的精准调控

靶向7-10层的13aa肽(peptide II)使完全二聚化概率降至38%，主要通过25倍加速D_TM-core解离实现。能量分析显示该肽选择性抬高D_TM-core能垒1.8k_BT，为"锚定-扰动"式抑制剂设计提供范式。

突变验证关键界面

第5层(I58A)和第7层(Q65A)突变导致解离力分布展宽，印证AAMD预测的7-8层是稳定性核心。特别是Q65A突变破坏局部静电网络，产生非天然二聚体构象。

这项研究突破性地实现了TM蛋白相互作用的高分辨率动态解析，建立"扩散-成核-延伸-锁定"的二聚化新范式。其技术创新在于：1) ELP连接器设计实现膜环境单分子操纵；2) 多尺度模拟与实验互证；3) 建立中间态与残基相互作用的定量映射。对于药物开发，揭示TM二聚化域具有"动力学可塑性"和"能量模块化"特征，为设计变构抑制剂提供新思路。特别是发现短肽可通过远端效应扰动TM域稳定性，这对CHAMPs类抗癌肽的优化具有指导意义。该平台可扩展至EGFR等疾病相关TM蛋白的研究，为精准干预异常二聚化提供分子标尺。