新型双芳基乙酰胺类自噬晚期抑制剂5j的发现及其通过胆固醇代谢重编程和ER应激调控的分子机制

这篇研究报道了通过表型高通量筛选发现的新型双芳基乙酰胺类自噬晚期抑制剂5d和5j。研究证实这些化合物能显著积累LC3-II、GABARAP-II和SQSTM1/p62蛋白水平，其作用机制涉及胆固醇生物合成通路激活、脂质代谢重编程和内质网(ER)应激反应。多组学分析揭示了5j独特的分子作用模式，为开发新型自噬靶向抗癌药物提供了重要线索。

　　

新型自噬晚期抑制剂的发现与表征

研究团队通过表型高通量筛选(HTS)从10,240个类药分子中鉴定出双芳基乙酰胺类化合物作为新型自噬调节剂。经过结构优化后获得的化合物5d和5j在HeLa和LNCaP细胞中表现出强效的自噬抑制作用。RFP-GFP-LC3报告系统显示这些化合物导致自噬体(黄色斑点)在核周区域聚集性积累，与经典晚期自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf A1)的表型相似。

Western blot分析证实5d和5j处理显著增加了LC3-II、GABARAP-II和SQSTM1/p62蛋白水平。值得注意的是，在HeLa细胞中，这些化合物与Baf A1联用未能进一步增加上述标志物水平，提示其对自噬通量的完全阻断作用。而在LNCaP细胞中观察到部分阻断效应，表明其抑制作用存在细胞类型依赖性。

分子作用机制的多组学解析

定量蛋白质组学分析揭示了5j处理后125个蛋白显著上调，其中10个与胆固醇生物合成通路直接相关。脂质组学数据显示多种脂质类别发生显著改变：羟基化神经酰胺(Cer)物种、甘油三酯(TG)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)18:0_20:4显著增加；而(醚)磷脂酰乙醇胺(PE)和(醚)磷脂酰胆碱(PC)物种则普遍下调。特别值得注意的是胆固醇水平升高，这与蛋白质组数据中胆固醇合成通路激活的发现相呼应。

磷酸化蛋白质组学鉴定出37个显著上调的磷酸化位点，包括脂肪酸合酶(FASN)T2204和微管相关蛋白1B(MAP1B)S1298/T2034位点。这些变化可能影响微管稳定性和自噬调控过程。

ER应激与溶酶体功能障碍的关联

机制研究发现5d和5j能诱导典型的内质网(ER)应激反应标志物表达上调，包括磷酸化eIF2α、BiP/GRP78、ATF4和钙联接蛋白(calnexin)。同时观察到前组织蛋白酶D(pro-cathepsin D)的积累，提示可能存在溶酶体功能受损。这些发现为理解双芳基乙酰胺类化合物的作用机制提供了新视角：通过干扰胆固醇代谢和诱导ER应激，进而影响自噬体-溶酶体融合过程。

结构-活性关系与药物优化

结构优化研究表明，在双芳基 scaffold 上引入甲基和氟原子可显著增强自噬抑制活性。化合物5d和5j作为对映异构体，相比HTS先导化合物1，其增加的疏水性可能改善了细胞渗透性。值得注意的是，结构修饰还成功降低了先导化合物的细胞毒性，使5d和5j在10μM浓度下对HeLa细胞活力影响最小。

治疗潜力与未来方向

目前临床使用的自噬抑制剂如氯喹存在脱靶效应和剂量限制性毒性等问题。双芳基乙酰胺类化合物展现出独特的作用机制：不同于V-ATPase抑制剂Baf A1，5j通过调节胆固醇代谢和诱导ER应激来抑制自噬晚期过程。这种多靶点作用模式可能带来更好的治疗窗口，为克服现有自噬抑制剂的局限性提供了新思路。未来研究将聚焦于优化化合物药效学性质，并探索其与常规抗癌药物的协同效应。