基于DESS保存液上清的非破坏性DNA提取技术在生物样本DNA条形码鉴定中的应用研究

（编辑推荐）本研究创新性地开发了从DESS（20% DMSO/250 mM EDTA/饱和NaCl）保存液中非破坏性提取DNA的技术，成功对室温保存10年的线虫样本和环境样品中的微型生物进行DNA条形码（COI/18S rRNA）鉴定，突破传统方法需破坏标本的局限，为分类学和生态学研究提供了形态与分子双重证据的解决方案。

　　

Abstract

研究团队开发了一种革命性的非破坏性DNA提取方法，利用DESS保存液（含20%二甲基亚砜DMSO、250 mM乙二胺四乙酸EDTA和饱和氯化钠）的上清液，成功实现了对保存10年的线虫标本和环境样本中微型生物的DNA条形码鉴定。该方法仅需500 μl保存液上清即可完成DNA提取，完整保留标本形态特征，解决了传统DNA提取需破坏珍贵标本的难题。

Method Summary

该技术通过硅胶吸附法从DESS上清中提取微量DNA，采用通用引物（如JB3/JB5靶向线虫COI基因，D512/D978靶向硅藻18S rRNA基因）进行PCR扩增。通过桑格测序和纳米孔测序（Nanopore Flongle R9.4）双平台验证，证实所获序列与形态学分类结果一致。特别值得注意的是，该方法对含多种生物的复杂环境样本（如海草根际沉积物中的微型底栖动物和硅藻）同样有效。

Highlights

1. 双保存突破：首次实现DESS保存液中DNA与形态学特征同步保存，标本可重复用于后续研究

2. 长期稳定性：对室温保存10年的线虫样本仍能有效提取DNA，打破传统冷冻保存限制

3. 环境样本应用：成功从含沉积物的海草根际样本中分离并鉴定 meiofauna（小型底栖动物）和硅藻

4. 技术互补性：对比发现桑格测序在均聚物区域（如poly-T）更准确，而纳米孔测序更适合混合物种鉴定

5. 方法普适性：适用于博物馆标本保存和野外环境调查，为生物多样性研究提供新范式

材料与方法

样本处理：

• 历史标本：采集自日本北海道太平洋沿岸的海洋线虫，在DESS中室温保存10年

• 环境样本：从千叶县海岸采集附有沉积物的海草（Phyllospadix japonicus），直接存入DESS溶液运输

关键技术步骤：

1. DNA提取：采用改良硅胶吸附法，结合盐酸活化硅胶颗粒和异丙醇沉淀

2. 低浓度处理：当DNA浓度低于检测限（NanoDrop/Qubit）时，通过磁珠纯化（Serapure/AMPure）进行PCR产物富集

3. 测序分析：使用ONTbarcoder和NGSpeciesID软件处理纳米孔数据，后者能有效识别样本中的混合物种

结果与讨论

历史标本验证：

从5个10年陈线虫样本中均成功扩增出COI条形码（约350 bp），其中样本3通过纳米孔测序意外检测到食道内容物中的Litinium sp.（占16%），揭示该方法在食物网研究中的潜力。样本5因DNA降解需二次PCR，证明该方法对低质量样本仍具适用性。

环境样本鉴定：

1. 动物样本：

   • 线虫Paracanthonchus sp.的形态与分子鉴定结果完全匹配

   • 端足类样本中发现COI假基因现象，通过氨基酸翻译验证测序可靠性

2. 硅藻样本：

   • 首次获得Arachnoidiscus sp.的18S rRNA序列

   • 在Biddulphia样本中检测到多毛类污染（占32%），凸显纳米孔测序的混合物种识别优势

技术对比：

• 准确性：桑格测序在均聚区域（如^G5/^T5）的错误率显著低于纳米孔测序

• 通量优势：纳米孔测序单次运行可识别样本3中占比仅16%的次要物种

结论与展望

该技术突破性地解决了小型生物DNA提取与形态保存不可兼得的矛盾，其应用可延伸至：

1. 分类学革新：建立兼具形态和分子证据的模式标本库

2. 野外调查：简化样本采集流程，实现环境样本室温保存运输

3. 技术融合：结合三代测序技术推动微型生物多样性研究

需注意EDTA对钙质生物（如有孔虫）的溶解作用可能限制该方法适用范围。随着纳米孔试剂升级（如R10.4.1流动槽），未来在homopolymer区域的测序精度有望进一步提升。