利用分裂池条形码单细胞RNA测序揭示牙龈卟啉单胞菌转录异质性及其在牙周病发病机制中的意义

这篇研究首次应用分裂池条形码单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术解析牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的转录异质性，发现6个功能特化亚群（含铁获取、应激响应等稀有亚群），为理解其免疫逃逸和慢性感染机制提供新视角，推动靶向牙周病治疗的精准策略开发。

　　

ABSTRACT

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是牙周炎的关键病原体，但其单细胞水平转录异质性尚未探索。研究通过分裂池条形码单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，在厌氧条件下培养的1,942个W83菌株细胞中鉴定出6个转录簇，其中两个主要簇占比72.7%，而稀有亚群表现出铁代谢、蛋白酶活性等特征，暗示其在环境适应和毒力调控中的特殊作用。

背景

作为革兰阴性厌氧菌，P. gingivalis通过菌毛、牙龈蛋白酶（gingipains）等毒力因子破坏宿主组织。传统群体转录组无法揭示其单细胞差异，而细菌scRNA-seq面临RNA含量低、细胞壁坚硬等技术挑战。本研究采用PETRI-seq（原核分裂池条形码技术），首次绘制该菌单细胞转录图谱。

材料与方法

菌株培养：W83菌株在含5%溶血羊血的TSA培养基（T-HK）或脑心浸液（B-HK）中厌氧培养至OD₆₀₀=0.35（对数中期）。

单细胞处理：甲醛固定后，通过三轮分裂池条形码（逆转录+两轮连接）标记转录本，最终构建cDNA文库并采用Illumina测序。

数据分析：使用PETRI-seq流程比对至W83基因组（GCF_002892595.1），Seurat软件聚类分析（分辨率0.35），筛选UMI≥15的细胞。

结果

数据质量：rRNA占比最高（图2a），但蛋白编码基因仍可检测，三批次数据UMI数稳定（图2c），UMAP显示批次效应可控（图3a左）。

主要聚类：

• Cluster 0（37.3%）：高表达核糖体基因（rplF、fusA），提示活跃蛋白质合成。

• Cluster 1（35.4%）：上调RNA聚合酶β亚基（rpoB）及铁受体基因（CF003_RS18045），可能参与代谢转换。

• 稀有亚群：Cluster 3（5.6%）富集分子伴侣（groL、clpB），Cluster 5（2.7%）表达DNA拓扑酶（topA）和金属蛋白酶（图3b）。

亚群功能：对主导簇（0和1）进一步分群发现：

• Sub-cluster C（13%）特异性高表达血红素受体hmuR（CF003_RS18805）、重金属ATP酶（CF003_RS18455）和ClpC蛋白酶（图5b），显示其在铁获取和应激响应中的关键作用。

讨论

研究发现P. gingivalis存在"功能分工"现象：活跃增殖、应激耐受、营养掠夺等亚群共存。这种异质性可能解释其治疗耐受性——例如，休眠亚群（Cluster 3）或能抵抗抗生素，而铁获取特化亚群（Sub-cluster C）在宿主缺铁环境中具有优势。尽管技术限制（如rRNA干扰）存在，该研究为靶向特定亚群的抗菌策略提供理论基础，未来需结合体内模型验证这些亚群的动态转换机制。

创新点

1. 首次实现P. gingivalis单细胞转录组解析

2. 发现稀有但功能关键的铁代谢亚群

3. 提出细菌异质性作为牙周炎治疗新靶点