使用不同检测方法，研究临床分离株和食品相关单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）菌株对一种商业噬菌体产品的敏感性

《Frontiers in Microbiology》：Susceptibility profile of clinical and food-associated Listeria monocytogenes strains to a commercial phage product using different test methods

李斯特菌噬菌体疗法敏感性评估显示存活率方法更高效，流式细胞术可在3小时检测到显著杀菌效果，传统噬菌斑试验存在漏检风险，建议优化检测方法以提升食品安全应用。

　　食品中的细菌性病原体仍然是全球健康和经济的重大负担，其中**李斯特菌**（*Listeria monocytogenes*）因其在食物中毒事件和召回中的频繁出现而成为主要关注对象。尽管李斯特菌具有在低温环境下生存和繁殖的能力，使得其在现代冷藏链中依然能够存在并传播，但近年来，基于噬菌体的生物控制产品被广泛认为是提升食品安全的有效工具。然而，对多种基因型的李斯特菌进行系统性评估的研究仍显不足。本研究针对德国近期分离的50株全基因组测序的临床和食品相关李斯特菌菌株，评估了一种商业化的李斯特菌特异性噬菌体产品（Phageguard L）的效果。

传统的斑点和噬斑实验（spot and plaque assays）显示，70%至76%的菌株对该噬菌体产品表现出敏感性。然而，基于存活率的检测方法，如菌落减少法、光密度（OD600）测量和流式细胞术，表明在24小时内，所有菌株均出现了显著的细菌数量减少。特别是流式细胞术，能够在3小时内检测到活菌数量的大幅下降。这提示我们，现代基于存活率的检测方法在评估噬菌体对食品中病原体的控制效果方面具有显著优势。虽然斑点和噬斑实验仍然是评估噬菌体感染力的重要工具，但它们在实际应用中可能无法全面反映噬菌体对细菌数量的减少能力。

### 李斯特菌的致病性与传播风险

李斯特菌是一种革兰氏阳性、杆状的病原体，能够感染动物和人类。它在冷藏温度下仍能生长和繁殖，这使得其在食品加工和储存过程中存在持续的传播风险。特别是在即食食品中，李斯特菌可能存在于鱼类及制品、肉类制品、蔬菜、果汁、奶酪等产品中。一旦被摄入，李斯特菌可能导致李斯特菌病，表现为胃肠道感染，但也可能引发严重的侵入性疾病，如败血症、脑膜炎和脑膜脑炎。在孕妇中，感染还可能导致流产或新生儿败血症。因此，李斯特菌对公共健康构成严重威胁。

### 噬菌体作为生物控制工具的潜力

近年来，基于噬菌体的生物控制产品被广泛应用于食品行业，旨在通过噬菌体的裂解作用来减少或消除食品中的李斯特菌。这些产品已在以色列、加拿大、中国、瑞士、澳大利亚和新西兰等国家获得批准，但在德国尚未通过监管审批。噬菌体P100是目前用于食品中李斯特菌控制的主要噬菌体之一，其作为Phageguard L的成分已被商业化应用。然而，现有研究对噬菌体的杀菌效果评估主要集中在少数菌株上，缺乏对多种基因型菌株的系统性分析。

本研究选择了50株具有代表性的李斯特菌菌株，其中包括20株临床分离的菌株和30株食品相关菌株。这些菌株均来自德国，并通过全基因组测序技术进行了基因型鉴定，以确保其多样性。为了全面评估噬菌体的杀菌效果，研究采用了多种检测方法，包括传统斑点和噬斑实验，以及基于存活率的菌落减少法、光密度测量和流式细胞术。这些方法在评估噬菌体对李斯特菌的杀菌能力方面各有特点。

### 传统检测方法的局限性

传统的斑点和噬斑实验虽然被认为是噬菌体敏感性的“金标准”，但其存在一定的局限性。首先，这些方法需要较长时间（通常为24至48小时）来观察菌落的形成和裂解，且结果依赖于人工判断，存在主观性和个体差异。其次，这些实验通常在较高的初始细菌浓度下进行，模拟的是实验室条件，而实际食品环境中的细菌数量往往远低于实验室条件，因此这些方法可能无法准确反映噬菌体在实际应用中的效果。

相比之下，基于存活率的检测方法，如菌落减少法和流式细胞术，能够更快地检测到细菌数量的减少，并且数据更为客观和可重复。菌落减少法通过将噬菌体与细菌混合后，观察其在培养基上的生长情况，从而评估噬菌体的杀菌效果。而流式细胞术则利用荧光染料（如SYTO 13和碘化丙啶）对活菌和死菌进行区分，能够在短时间内（3小时内）检测到细菌数量的显著下降。这种技术不仅提高了检测效率，还能够提供更精确的细菌存活率数据。

### 现代检测方法的优势

在本研究中，流式细胞术的结果尤为显著。与传统的斑点和噬斑实验相比，流式细胞术能够在更短的时间内提供更准确的存活率数据。例如，在3小时的实验后，大多数菌株的活菌数量已显著下降，而传统方法在相同时间内可能尚未观察到明显的裂解现象。此外，流式细胞术还能够检测到细胞膜完整性变化，这为细菌的存活状态提供了更全面的评估。而OD600测量法通过监测细菌培养液的光密度变化，间接反映了细菌的生长情况，同样表现出较高的敏感性和可重复性。

尽管这些现代方法在检测细菌数量减少方面表现出色，但它们仍存在一定的局限性。例如，OD600测量法主要依赖于细菌的生长状态，而无法直接区分活菌和死菌。此外，流式细胞术虽然能够提供更精确的存活率数据，但其操作过程相对复杂，需要专业的设备和熟练的技术人员。因此，在实际应用中，可能需要结合多种方法以确保结果的准确性和可靠性。

### 实验设计与结果分析

为了确保实验的严谨性和可重复性，本研究采用了多种实验设计。首先，所有菌株均在标准条件下进行培养，以确保其活性。然后，通过不同的检测方法（包括斑点和噬斑实验、菌落减少法、OD600测量和流式细胞术）评估噬菌体的杀菌效果。实验结果显示，噬菌体P100对大多数菌株具有显著的杀菌效果，尤其是在基于存活率的检测方法中。

在斑点和噬斑实验中，70%至76%的菌株表现出敏感性，但部分菌株的噬斑形成较为困难，甚至无法观察到明显的裂解现象。这可能与菌株的基因型或噬菌体的浓度有关。相比之下，菌落减少法和流式细胞术能够更快速、更准确地检测到细菌数量的减少，尤其是在3小时的实验后，几乎所有菌株的活菌数量均显著下降。这表明，基于存活率的检测方法在实际应用中可能更具优势。

### 遗传背景与噬菌体敏感性的关系

本研究还探讨了噬菌体敏感性与菌株遗传背景之间的关系。尽管部分菌株表现出较低的敏感性，但总体来看，没有发现与敏感性存在显著的基因型关联。这可能意味着，李斯特菌的敏感性主要受环境因素和噬菌体浓度的影响，而非特定的基因型。然而，研究中仅检测了少数菌株，因此无法排除某些基因型可能对噬菌体具有更强的抗性。未来的研究需要对更大数量的菌株进行基因组分析，以进一步探讨敏感性与遗传背景之间的潜在联系。

### 应用前景与挑战

尽管本研究的结果表明，Phageguard L噬菌体产品对大多数李斯特菌菌株具有良好的杀菌效果，但在实际应用中仍面临一些挑战。首先，食品环境中的细菌浓度通常较低，而实验室条件下的高浓度可能无法准确反映实际效果。其次，噬菌体的杀菌效果可能受到多种因素的影响，如温度、pH值、营养成分等。因此，在实际应用中，需要对这些因素进行综合考虑。

此外，噬菌体在食品中的应用还面临监管和公众接受度的问题。虽然一些国家已批准噬菌体产品的使用，但在德国等国家仍需进一步的评估和审批。这可能与当地法规、食品安全标准以及公众对噬菌体技术的认知有关。因此，推动噬菌体技术在食品行业的应用，不仅需要科学验证，还需要政策支持和公众教育。

### 结论与建议

本研究的结果表明，基于噬菌体的生物控制产品在食品中具有广泛的应用前景。Phageguard L噬菌体产品对多种基因型的李斯特菌菌株表现出显著的杀菌效果，尤其是在基于存活率的检测方法中。然而，为了更全面地评估噬菌体的杀菌能力，未来的研究需要结合多种检测方法，并考虑实际食品环境中的复杂因素。此外，研究还建议重新评估传统斑点和噬斑实验在噬菌体敏感性测试中的适用性，以更准确地反映噬菌体在实际应用中的效果。

总体而言，噬菌体技术为食品安全提供了新的解决方案，尤其是在对抗抗生素耐药性方面具有独特优势。然而，其广泛应用仍需克服技术、法规和公众认知等方面的挑战。通过进一步的研究和创新，噬菌体有望成为食品行业对抗李斯特菌等病原体的重要工具。