苜蓿转录因子MsNAC2a通过调控活性氧积累与硫化氢代谢平衡盐胁迫响应稳态的分子机制

本研究揭示了苜蓿NAC转录因子MsNAC2a通过抑制硫化氢（H2S）合成基因MsLCD1表达、促进代谢基因MsOASA1表达，同时抑制活性氧（ROS）清除基因MsCOX11，从而降低H2S水平并增加ROS积累，最终负调控植物耐盐性的新机制。研究发现MsNAC2a与AP2/ERF型转录因子MsEREBP1存在体内外互作，共同精细调控内源H2S稳态，为作物抗逆育种提供了新靶点。

　　

苜蓿盐胁迫响应的分子调控网络

1 引言

作为"牧草之王"的紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是全球重要的饲用作物，但土壤盐渍化严重制约其生产。植物通过复杂的信号网络应对盐胁迫，其中NAC和AP2/ERF转录因子家族起关键调控作用。硫化氢（H₂S）作为第三类气体信号分子，在植物抗逆中发挥重要作用，但其在苜蓿耐盐性中的调控机制尚不明确。

2 结果

2.1 MsNAC2a作为盐响应因子的克隆与鉴定

从紫花苜蓿中克隆获得MsNAC2a基因，系统进化分析显示其与水稻OsNAC2和小麦TaNAC2具有较高同源性。qRT-PCR表明该基因在盐胁迫6小时后表达量激增40倍，且外源H₂S和ABA均可诱导其表达。亚细胞定位证实MsNAC2a为核定位蛋白，酵母实验显示其具有转录激活活性。

2.2 MsNAC2a增强苜蓿对盐胁迫的敏感性

通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术构建的TRV-MsNAC2a植株表现出显著增强的耐盐性。稳定遗传的过表达株系（MsNAC2a-OE）在500 mM NaCl处理5天后出现严重萎蔫，而RNA干扰株系（MsNAC2a-RNAi）则保持较好长势。生理指标检测显示过表达株系的鲜重、Fv/Fm值显著降低，电解质渗漏率升高。

2.3 MsNAC2a通过驱动ROS积累和H₂S降解降低耐盐性

组织化学染色显示MsNAC2a-OE植株中H₂O₂和O₂^-积累显著增加。酶活检测发现过表达株系SOD、CAT、POD和APX活性降低，MDA含量升高。值得注意的是，盐胁迫下过表达株系内源H₂S水平降低42%，而RNAi株系升高65%。外源施加H₂S供体NaHS可部分挽救过表达株系的盐敏感表型。

2.4 MsNAC2a调控ROS清除和H₂S合成/代谢相关基因

qRT-PCR分析发现MsNAC2a-OE株系中ROS清除基因MsSOD1、MsSOD3、MsCAT、MsAPX1和MsCOX11表达下调，而H₂S合成基因MsLCD1表达降低，代谢基因MsOASA1表达升高。离子转运基因MsSOS1和MsNHX1的表达未受显著影响。

2.5 MsNAC2a直接结合靶基因启动子调控表达

染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）、电泳迁移率实验（EMSA）和双荧光素酶报告系统证实MsNAC2a通过结合MsOASA1启动子的TAGC顺式元件激活其表达，同时抑制MsLCD1和MsCOX11的转录。酵母单杂交（Y1H）验证了这些直接调控关系。

2.6 MsLCD1过表达增强苜蓿耐盐性

构建的MsLCD1-OE转基因株系表现出显著增强的耐盐性，鲜重提高35%，电解质渗漏率降低28%，内源H₂S水平增加1.8倍。在MsNAC2a-RNAi背景下沉默MsLCD1会导致耐盐性丧失，证实MsLCD1是MsNAC2a的下游效应因子。

2.7 MsEREBP1与MsNAC2a互作调控其转录活性

酵母双杂交（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）实验证实MsEREBP1与MsNAC2a存在物理互作。双荧光素酶报告系统显示MsEREBP1能减弱MsNAC2a对下游靶基因的调控作用。在MsNAC2a-OE背景下沉默MsEREBP1会加剧盐敏感表型。

3 讨论

本研究首次揭示了苜蓿MsNAC2a-MsEREBP1-H₂S信号模块调控耐盐性的分子机制。MsNAC2a通过双重调控H₂S代谢平衡（抑制合成、促进降解）和ROS清除系统，成为盐胁迫响应的关键负调控因子。与水稻OsNAC2类似，MsNAC2a也表现出转录激活和抑制的双重功能。

4 结论

该研究阐明了MsNAC2a通过调控H₂S稳态和ROS积累负调控苜蓿耐盐性的分子机制，发现了MsNAC2a-MsEREBP1互作模块的重要功能，为牧草和作物抗逆遗传改良提供了新思路和分子靶点。