miR164a-NACs调控系统揭示桃果实组织特异性花青素积累的分子机制

这篇研究揭示了桃果实中miR164a-NACs（NAM/ATAF/CUC）转录因子调控模块通过抑制-激活机制控制组织特异性花青素积累的分子机制。研究发现PpNAC22和PpNAC100通过形成同源二聚体直接激活PpMYB10.1启动子，而其转录本被miR164a特异性切割；同时发现PpNAC29通过异源二聚体形式间接参与调控，形成miR164a-PpNAC22/100-PpNAC29级联通路。该研究为蔷薇科果实品质改良提供了新靶点。

　　

引言：花青素作为水溶性色素决定果实色泽与营养价值

花青素作为一类重要的水溶性色素，赋予植物组织从红色到蓝色的丰富色彩，在吸引传粉者和抵抗生物/非生物胁迫中发挥关键作用。这类次生代谢产物还具有调节血糖、抗衰老等健康功效。其生物合成途径高度保守，涉及PAL、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR、ANS和UFGT等关键酶，最终产物通过GST转运至液泡。该途径主要受MYB-bHLH-WDR（MBW）复合体调控，其中R2R3-MYB转录因子（TF）是核心调控元件。

结果1：PpNAC22/100通过同源二聚体激活PpMYB10.1

通过对桃品种'锦绣'和'湖景蜜露'的果皮（P）、近皮外层果肉（OF）和近核内层果肉（IF）比较转录组分析，鉴定出204个差异表达基因。其中PpNAC22和PpNAC100通过形成同源二聚体直接结合PpMYB10.1启动子的NAC顺式元件（[TA]NN[CT][TCG]TNNNNNNNA[AC]GN[ACT][AT]），分别激活其表达2.7倍和3.7倍。亚细胞定位显示这两个蛋白主要定位于细胞核，但信号较弱，暗示存在转录后调控。

结果2：miR164a介导PpNAC22/100转录本切割

生物信息学预测和降解组测序证实，miR164a在PpNAC22（914bp处）和PpNAC100（1137bp处）转录本的10-11nt位置进行特异性切割。通过构建靶位点突变体PpNAC22m/100m（红色荧光信号增强7.2/6.6倍）和短串联靶标模拟物STTM164验证，发现IF组织中miR164a低表达导致PpNAC22/100高表达。瞬时过表达实验显示，miR164a可完全抑制PpNAC22/100驱动的花青素积累。

结果3：PpNAC29通过异源二聚体间接调控

PpNAC29虽不能直接结合PpMYB10.1启动子，但通过其C端转录激活域与PpNAC22形成异源二聚体（Y2H和BiFC验证）。有趣的是，PpNAC22/100能激活PpNAC29启动子（3.7/3.6倍），形成miR164a-PpNAC22/100-PpNAC29级联通路。该基因不受miR164a调控，在烟草中共表达PpNAC29、proPpMYB10.1::PpMYB10.1和PpbHLH3可产生35.4mg/100g FW花青素。

讨论：miR164a-NACs模块的生物学意义

该研究首次报道miR164通过切割NAC转录因子调控花青素积累的机制。系统发育分析显示该模块在蔷薇科中可能保守存在。与已报道的PpBL/PpNAC1-5不同，新发现的PpNAC22/100/29具有组织特异性表达模式。值得注意的是，这些NACs还可能参与叶绿素降解，导致烟草叶片黄化现象。该调控网络为解释桃果实"外白内红"表型提供了分子基础，也为其他蔷薇科果实的品质改良提供了新思路。

实验方法：多技术平台验证机制

研究采用SH培养基诱导桃愈伤组织（含0.5mg/L 2,4-D和TDZ），通过农杆菌介导的瞬时转化（OD₆₀₀=0.8）进行功能验证。利用双荧光素酶报告系统（LUC/REN）、酵母单杂交（Y1H，含AbA抗性）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证蛋白-DNA相互作用。蛋白互作通过酵母双杂交（QDO/X-α-Gal培养基）和双分子荧光互补（BiFC）证实。花青素检测采用HPLC（C18柱，520nm检测波长），以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准品。