SNAr反应性N-(6-氟-3-硝基吡啶-2-基)异喹啉-3-胺类共价USP7抑制剂的设计、合成与分子评价揭示非常规结合模式

本文报道了一类通过亲核芳香取代反应（SNAr）靶向泛素特异性蛋白酶7（USP7）催化半胱氨酸Cys223的新型共价抑制剂。研究通过分子对接设计、化合物合成及生物物理评价（DSF、质谱分析）发现先导化合物7a能以非常规结合模式作用于USP7催化三联体区域，其晶体结构（2.26 ?分辨率）为开发高选择性USP7抑制剂提供了新思路。该工作拓展了共价弹头类型，为靶向肿瘤发生相关通路提供了新策略。

　　

分子对接引导的非常规结合模式发现

通过AutoDock对先导化合物7a进行共价对接，意外发现其倾向于结合USP7催化三联体区域（His⁴⁶⁴/Asp⁴⁸¹），而非传统的泛素结合通道。这种结合模式（对接得分-7.68）与已报道的USP7抑制剂取向相反，为后续结构优化提供了全新方向。

多步骤合成与结构修饰

研究以3-氯-5-溴异喹啉为起点，通过Suzuki偶联、Buchwald-Hartwig胺化等反应构建了15个衍生物。关键步骤包括：硼酸酯区域选择性偶联（收率37%-93%）、苯甲酮亚胺介导的胺化（收率5%-90%），以及2,6-二氟-3-硝基吡啶的SNAr反应（收率3%-53%）。氟/氯离去基团的差异化设计为反应活性调控提供了可能。

生物物理验证体系

采用差异扫描荧光法（DSF）监测蛋白热稳定性变化，发现氟代衍生物7a在24小时孵育后使USP7和USP7asoc的T_m分别降低4.2°C和6.18°C。完整蛋白质谱证实其共价修饰主要靶向催化Cys²²³，而氯代类似物8a修饰效率显著降低。值得注意的是，N-丙基吡唑衍生物7d表现出最佳抑制活性（IC₅₀=27 μM），较先导化合物提升近2倍。

晶体结构揭示作用机制

2.26 ?分辨率的共晶结构（PDB:9QJE）首次证实7a通过SNAr反应共价修饰Cys²²³，其异喹啉骨架与相邻α螺旋形成空间限制，而吡唑氮原子取代基伸向催化三联体区域。这种"反向结合"模式突破了传统USP7抑制剂的结合方向，为后续基于结构的药物设计奠定了基础。

构效关系与转化潜力

研究发现：1）吡唑环第二氮原子对结合至关重要，去除后活性下降（7b IC₅₀=57 μM）；2）N-烷基链延长可增强活性（7d>7c>7a），但环丙基空间位阻导致活性回落；3）大体积萘基（7g）或联芳基（7i）显著降低结合效率。该工作不仅丰富了SNAr型共价弹头的结构多样性，更为开发靶向USP7非典型结合位点的抗癌药物提供了新思路。