胶原/羟基磷灰石水凝胶促进细胞间相互作用与成骨分化的创新研究

本研究创新性地将MG63成骨细胞封装于胶原/羟基磷灰石（HA）复合水凝胶（5:5最优配比）中，并整合至3D打印聚乳酸（PLA）支架，显著提升细胞增殖、ALP活性及矿化能力。通过FE-SEM和micro-CT证实该体系可加速骨样组织形成，为骨缺损修复提供新型生物活性支架设计策略。

　　

1 引言

骨缺损修复面临临床重大挑战，传统策略难以满足需求。胶原作为骨基质主要有机成分虽具生物相容性，但缺乏促成骨活性。研究将羟基磷灰石（HA）引入胶原水凝胶，结合3D打印PLA支架的结构优势，构建仿生微环境。MG63细胞封装于5:5胶原/HA水凝胶后，通过直接细胞-材料互作激活成骨信号通路，较传统混合支架展现出显著优势。

2 材料与方法

2.1 复合水凝胶制备与细胞封装

1型胶原（1 mg/mL）与HA粉末（1% w/v）按5:5、4:6、3:7比例混合，超声分散后封装MG63细胞（1×10⁶ cells/mL）。2.2 3D打印支架采用PLA材料打印9层网格结构（6.59×6.59×3.31 mm），经乙醇/UV灭菌后负载细胞水凝胶。2.3 成骨诱导培养基添加10^-8 M地塞米松、10 mM β-甘油磷酸及100 ng/mL BMP-2。

检测手段包括：

• 活死染色：Calcein-AM/EthD-1双染量化存活率

• ALP活性：pNPP底物法测定450 nm吸光度

• qPCR：分析ALP、COL1A1、Osterix（OSX）、OPN基因表达

• 矿化评估：阿尔新红（ARS）染色结合560 nm定量

• 显微结构：FE-SEM观察矿化结节

• 三维重建：Micro-CT计算骨体积（BV）

3 结果

3.1 水凝胶优化与细胞活性

5:5组初期存活率较低但增殖最快（Day 7达峰值），显著优于4:6/3:7组（p<0.001）。胶原/HA组Day 3活细胞荧光强度较纯胶原组提升2.1倍。

3.2 成骨分化

ALP活性：Day 14时胶原/HA组ALP达35.2 IU/L，较对照组高68%（p<0.05）。基因表达：OSX在Day 14上调4.3倍，COL1A1早期显著增加但后期趋缓。

3.3 矿化特征

ARS染色：Day 21胶原/HA组吸光度值超对照组2.8倍。FE-SEM：Day 30时HA组矿化颗粒完全覆盖胶原纤维，而对照组仍可见纤维网络。Micro-CT：HA组BV/TV值达82.4%，接近完全矿化。

4 讨论

5:5配比实现胶原生物活性与HA成骨诱导的平衡：

• 机械性能：最优流变学特性保障细胞均匀分布

• 信号激活：HA直接促进钙磷核化，加速COL1A1沉积

• 结构优势：PLA支架孔隙率（≈75%）支持营养渗透

与传统HA共混支架相比，细胞封装策略使ALP活性提升1.7倍，矿化周期缩短40%。

5 结论

该研究证实胶原/HA（5:5）水凝胶联合3D打印PLA支架可同步优化细胞微环境与宏观结构，为临床骨再生提供可定制化解决方案。未来需进一步开展大型动物实验验证其负载能力。