逆向工程改造的气体发酵产乙酸菌株通过自养适应性实验室进化恢复增强表型

这篇研究通过逆向工程改造产乙酸菌株Clostridium autoethanogenum的关键基因CLAU_0471（氨基酸通透酶），结合系统生物学分析，揭示了该基因缺失可显著提升菌株的自养生长速率、生物反应器鲁棒性及2,3-丁二醇（2,3-BDO）产量。研究证实了适应性实验室进化（ALE）筛选的基因靶点能独立恢复优良表型，为理解产乙酸菌代谢调控网络提供了新视角。

　　

引言

全球气候变暖背景下，利用气体发酵技术将工业废气（CO/CO₂）转化为燃料和化学品是实现碳中和的重要途径。产乙酸菌（如Clostridium autoethanogenum）因其高效的Wood-Ljungdahl碳固定途径（WLP）成为理想催化剂，但多数基因功能未知限制了其工程化改造。前期适应性实验室进化（ALE）筛选到多个突变菌株，本研究通过逆向工程验证关键基因的功能。

实验方法

菌株构建：采用CRISPR/Cas9技术删除高频突变基因CLAU_0471，构建RE3菌株，并与先前改造的RE1（Spo0A缺失）和RE2（CLAU_1957 SNP）进行比较。

培养条件：在无酵母提取物（YE）的化学限定培养基中，通过批次瓶培养和连续生物反应器培养评估菌株性能，结合质谱和HPLC分析代谢产物。

组学分析：采用DIA质谱技术比较RE3与野生型JA1-1及ALE优良菌株LAbrini的蛋白质组差异。

结果与讨论

表型恢复：

• RE3在无YE条件下自养生长速率（μ_max）达0.072 h^-1（CO为底物），较野生型提升2.5倍，但低于RE1（0.1 h^-1）。

• 生物反应器中，RE3展现出低气体敏感性，且2,3-BDO产量显著升高（1.4倍于LAbrini），表明CLAU_0471缺失可能通过未知调控网络增强还原代谢。

代谢重编程：

• 蛋白质组显示RE3中甲酸脱氢酶（13975）和醇脱氢酶（Adh4）表达上调4倍，与碳流向还原产物一致。

• 结构预测揭示CLAU_0471可能具有跨膜信号传导功能，其缺失或影响孢子形成相关通路（如Spo0A网络）。

进化启示：

• CLAU_1957（双组分调控因子）与Spo0A的N端结构域高度保守，暗示二者在古老调控网络中功能关联。

• 单基因改造虽未完全复现ALE菌株表型，但避免了多突变导致的适应性代价（如培养不稳定性）。

结论

研究证实CLAU_0471、CLAU_1957和Spo0A是产乙酸菌自养生长的关键调控节点，其改造可独立提升工业性能。未来需探究多基因组合编辑以解锁ALE菌株的全部潜力。