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高通量测序CODEX方法：基于cox-1条形码片段的新腹足类物种鉴定与退化DNA分析
【字体： 大 中 小 】 时间：2025年08月12日 来源：Molecular Ecology Resources 5.5
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本文推荐一种创新的双索引高通量测序（HTS）方法CODEX，通过扩增cox-1基因重叠片段解决传统桑格测序（Sanger）对降解样本的局限性。该方法在15,076例新腹足类样本中实现72.33%成功率，成本降至�0.5/序列，为博物馆藏品分子系统学研究提供高效方案。
ABSTRACT
DNA条形码技术长期依赖桑格测序，但对降解样本效果有限。CODEX方法通过双索引HTS策略，成功对法国国家自然历史博物馆（MNHN）收藏的新腹足类标本进行cox-1片段测序。研究处理15,076样本，获得10,905条有效序列，成本仅为传统方法的1/9。结果显示，标本保存年限与测序成功率显著负相关，而引物设计覆盖了该类群的高度多样性。
1 Introduction
尽管多基因位点分析已成为物种界定的金标准，单基因条形码（如cox-1）仍在大规模标本鉴定中发挥关键作用。传统桑格测序难以处理降解DNA样本，而HTS通过多重索引策略可单次运行处理上万样本。本研究针对新腹足类——现存近1.6万种的海洋软体动物类群，其形态鉴定困难且存在大量隐存种。CODEX方法通过设计重叠片段引物（LCO1490-CODEXNEO/HCO2198-CODEXNEO等），结合96孔板双标签系统，显著提升古旧标本的条形码获取效率。
2 Materials and Methods
2.1 采样与DNA提取
标本主要来自MNHN近20年科考（如BIOPAPUA、MADIBENTHOS等），采用微波快速固定技术保存。DNA提取使用Macherey-Nagel 96孔板试剂盒，分两批处理67和91板样本。
2.2 PCR与测序
设计4对特异性引物覆盖cox-1全长，5'端含独特5bp标签。PCR体系加入5% DMSO提升扩增效率，40循环后使用Illumina MiSeq 2×300 V3双端测序。
2.3 CODEX流程
生物信息学管道包含五步：
fastp合并双端读长（>300bp保留）
基于BLAST的96孔板初筛
Trinity组装各片段
minimap2比对评估覆盖度
人工校验非重叠区并拼接
2.4 后处理
通过BLAST剔除非腹足类污染，MEGA6构建NJ树（p-distance模型）鉴定科内污染。重点分析芋螺科（Conidae）和蛙螺科（Bursidae）的种内变异。
3 Results
两批数据分别获得160M和165M读长，总体成功率72.33%。完整cox-1序列占70.1%（9,551例），单片段序列占18.3%。关键发现包括：
2000年前标本成功率仅40%，2019年后达85%
蛙螺科成功率最高（86.83%），而Cancellariidae异常偏低
芋螺科中19.47%为科内污染，推测全数据集污染率约20%
4 Discussion
CODEX相较桑格测序的优势体现在：
对1980年代标本仍有70%回收率
成本降低90%
引物适配16,000种新腹足类的遗传多样性
局限性包括HTS固有错误率（0.1%错配）和需人工校验嵌合体。研究强调标本即时冷冻保存的重要性，并揭示采集年代（非分类单元或个体大小）是成功率的关键预测因子。
应用前景
该方法为博物馆珍藏标本的大规模分子鉴定建立新标准，特别适用于：
历史模式标本DNA回溯
隐存种快速筛查
海洋生物多样性评估
（注：全文数据与代码已开源，详见补充材料SS1-SS6）
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