T细胞相关诊断模型与PRF1介导的糖酵解在脓毒症中的作用机制：单细胞与转录组学证据及实验验证

本研究针对脓毒症早期诊断困难及免疫机制不清的临床难题，通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和转录组数据，构建了基于15个T细胞相关标志基因（如PRF1、LAG3等）的诊断模型（AUC 0.7-1.0），并首次揭示穿孔素（PRF1）通过调控糖酵解关键通路（G3P→3PD、PKM2等）驱动CD8+ T细胞免疫失衡的分子机制。实验验证显示PRF1敲除可显著降低炎症因子（TNF-α/IL-1β）和乳酸水平，为脓毒症提供了新的生物标志物和治疗靶点。

　　

脓毒症是全球范围内导致死亡的主要危重症之一，每年造成超过1100万患者死亡。这种由感染引发的全身炎症反应综合征，早期症状隐匿且易与其他感染性疾病混淆，现有临床评分系统（如SOFA）难以精准识别个体差异。更棘手的是，脓毒症患者往往同时存在过度炎症和免疫抑制的双相障碍——初期"细胞因子风暴"导致器官损伤，后期则出现T细胞耗竭等免疫瘫痪现象。其中CD8⁺ T细胞比例异常已被证实与疾病严重程度密切相关，但具体调控机制仍是未解之谜。

针对这一临床痛点和科学问题，研究人员开展了一项多组学整合研究。通过分析29例脓毒症和36例对照的单细胞转录组数据，首次系统描绘了脓毒症免疫细胞图谱，发现T细胞（尤其是CD8⁺ T细胞）是疾病进展的核心调控者。差异基因富集分析显示，这些细胞显著激活了T细胞分化（P<0.05）和细胞毒性相关通路。基于此，团队利用LASSO算法从46个T细胞特征基因中筛选出15个关键标志物（含PRF1、LAG3等），构建的诊断模型在6个独立队列（n=396）中展现出稳定预测效能（AUC 0.88）。

代谢分析揭示PRF1与糖酵解通路（G3P→3PD等）呈强负相关。动物实验证实，CLP（盲肠结扎穿孔）模型小鼠的CD4⁺/CD8⁺ T细胞比值显著降低（P<0.01），同时PRF1表达和乳酸水平升高2.3倍。体外实验进一步表明，LPS诱导的巨噬细胞中PRF1 knockdown可使糖酵解标志物PFKFB3/PKM2下降40%，并通过Seahorse检测证实其调控ECAR（细胞外酸化率）和OCR（耗氧率）的能力。这些发现为理解脓毒症免疫代谢重编程提供了新视角。

关键技术方法包括：

1. 整合29例脓毒症单细胞数据和6个GEO队列（n=396）的转录组分析

2. 采用Seurat进行细胞聚类和CD8⁺ T细胞亚群鉴定

3. LASSO回归构建15基因诊断模型

4. scFEA（单细胞通量估算）分析代谢网络

5. CLP小鼠模型和LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞模型验证

T cell serves as the important cell in sepsis

单细胞分析揭示脓毒症中T细胞（特别是CD8⁺亚群）比例异常，其46个差异基因主要富集于T细胞激活和NK细胞毒性通路（P<0.05）。

Different gene expression patterns between sepsis and health control

跨数据集分析鉴定出16个核心差异基因（如TLR5、HK3），在感染组中主要调控T细胞行为，在健康对照组中参与感染应答。

Diagnostic model for sepsis

基于UBE2C、PRF1等15个T细胞标志物构建的模型，在训练集（GSE134347）和验证集中AUC达0.7-1.0。

Metabolic alteration in sepsis

scFEA显示脓毒症T细胞的G3P→3PD等糖酵解通路活性显著增强（LogFC>0.2，P<0.001），与PRF1表达呈负相关。

PRF1 and glycolysis alteration in sepsis in vivo

CLP模型证实PRF1上调伴随CD4⁺/CD8⁺比值下降（P<0.01），糖酵解标志物PFKFB3/PKM2升高1.8倍。

PRF1 regulates glycolysis in sepsis

LPS实验中PRF1 knockdown使乳酸水平降低35%，并通过调控ECAR/OCR逆转糖酵解亢进（P<0.05）。

这项研究首次建立了T细胞相关的脓毒症诊断体系，并阐明PRF1通过"糖酵解-免疫失衡"轴调控疾病进展的新机制。临床转化方面，15基因模型为早期诊断提供了高特异性工具；基础研究层面，发现PRF1可同时作为预后标志物（ROC 0.88）和治疗靶点（敲除后炎症因子下降40%）。值得注意的是，该研究揭示了免疫代谢重编程在脓毒症双相障碍中的枢纽作用——糖酵解亢进既驱动初期炎症风暴，又导致后期T细胞耗竭，这一发现为开发靶向代谢的免疫调节疗法奠定了理论基础。