内质网多分子伴侣凝聚体通过相分离机制增强蛋白质折叠效率

本研究揭示了内质网(ER)中蛋白质二硫键异构酶PDIA6通过Ca2+依赖的相分离形成多分子伴侣凝聚体，作为"蛋白质折叠工厂"的重要机制。研究人员发现PDIA6凝聚体能选择性招募Hsp70(BiP)、Hsp90(Grp94)等早期折叠相关伴侣蛋白，显著提高胰岛素原等客户蛋白的折叠效率。该发现为理解内质网蛋白质质量控制提供了新视角，并为糖尿病、癌症等蛋白质折叠相关疾病的治疗带来新思路。

　　

在真核细胞中，约三分之一的蛋白质需要在内质网(ER)中完成正确折叠，这一过程依赖于复杂的分子伴侣网络。然而，长期以来科学家们对分子伴侣如何高效协同工作、特别是如何应对内质网应激条件下的蛋白质折叠危机知之甚少。蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族成员PDIA6的异常与糖尿病、癌症等多种疾病相关，但其具体分子机制一直是个谜团。

来自国外研究机构的研究人员通过多学科交叉方法，首次揭示了PDIA6通过相分离形成动态多分子伴侣凝聚体的全新机制。这项发表在《Nature Cell Biology》的研究表明，这些"蛋白质折叠工厂"能够响应细胞状态动态重组，为理解内质网蛋白质质量控制提供了全新视角。

研究人员综合运用了荧光显微成像(包括FRAP技术)、核磁共振(NMR)波谱分析、X射线晶体学、体外重构实验等多种技术手段。通过构建PDIA6-Halo基因敲入细胞系，结合活细胞成像追踪内源性PDIA6的动态行为；利用甲基特异性标记和近完全骨架指认的NMR技术解析PDIA6构象变化；通过晶体学手段解析了PDIA6 domain b的1.8?高分辨率结构；并建立了体外重构系统验证Ca²⁺依赖的相分离现象。

【PDIA6形成相分离凝聚体】

研究发现内源性PDIA6在内质网中并非均匀分布，而是形成动态的簇状结构。这些簇状结构表现出典型的相分离特征：可发生融合与分裂事件，荧光漂白恢复(FRAP)半衰期约78±14秒，扩散系数为4±1×10^-3 μm² s^-1。过表达PDIA6会形成更大但性质相似的凝聚体，且在HEK和U2OS等多种细胞系中均观察到类似现象。

【PDIA6凝聚体响应内质网应激】

当用衣霉素(tunicamycin)或毒胡萝卜素(thapsigargin)等诱导ER应激时，PDIA6凝聚体会发生可逆性解离。值得注意的是，不同应激源导致的解离动力学差异显著：毒胡萝卜素(通过快速耗竭ER腔Ca²⁺)可在1小时内完全解离凝聚体，而衣霉素(通过抑制N-糖基化)需要6小时。这表明PDIA6凝聚体的形成与维持受ER腔内Ca²⁺浓度调控。

【PDIA6结构与Ca²⁺结合位点】

通过整合结构生物学方法，研究人员解析了PDIA6的全原子模型。PDIA6包含两个催化活性的硫氧还蛋白样结构域(domain a⁰和a)和一个功能未知的非活性domain b。研究发现PDIA6通过domain a⁰中的α4螺旋形成二聚体，这与PDI家族其他单体成员不同。更重要的是，通过Gd³⁺滴定和NMR实验鉴定出三个Ca²⁺结合位点，其中位点I和II位于domain a-b界面和domain b内部，位点III位于无序的C端尾部。

【分子开关调控凝聚体形成】

研究表明PDIA6相分离需要两种分子间相互作用：高亲和力的domain a⁰二聚化以及domain a⁰-a连接区与domain b之间的瞬态静电相互作用。关键的带正电连接区(R142、K150、R153、K159和K160)中和突变会完全抑制凝聚体形成。这种"双价"相互作用模式解释了PDIA6如何响应Ca²⁺浓度变化调控相分离。

【PDIA6招募其他伴侣蛋白】

免疫染色显示内源性BiP与PDIA6凝聚体共定位。NMR实验证实PDIA6通过domain b与BiP的核苷酸结合域(NBD)相互作用，解离常数K_D≈50μM。此外，BiP辅助伴侣ERdj3、PDIA1和Grp94也选择性富集于PDIA6凝聚体中，而参与后期加工的凝集素伴侣(calreticulin和calnexin)则不被招募。这表明PDIA6凝聚体特异地浓缩了早期折叠机器的主要组分。

【伴侣凝聚体作为折叠工厂】

以胰岛素原为模型客户蛋白的研究显示，胰岛素原高度富集于PDIA6凝聚体中(PCC=0.93±0.1)。功能实验证明，不能形成凝聚体的PDIA6 5×连接区突变体导致胰岛素分泌减少和细胞内胰岛素原积累。此外，缺失PDIA6凝聚体会导致XBP1剪接增加、蛋白质聚集增多和ER膜流动性降低，显著影响细胞活力。这些结果强有力地表明PDIA6凝聚体通过防止蛋白质聚集和增强折叠鲁棒性发挥重要作用。

这项研究首次揭示了内质网中多