基于DIA-MS的无标记氧化还原蛋白质组学揭示氧化应激下前列腺癌细胞翻译机器中半胱氨酸氧化的关键作用

推荐：研究人员针对氧化应激诱导的蛋白质半胱氨酸氧化修饰机制不明的问题，开发了基于数据非依赖性采集质谱(DIA-MS)的无标记氧化还原蛋白质组学方法(DIALRP)，系统分析了前列腺癌细胞DU145在甲萘醌(MND)诱导的氧化应激下3665个半胱氨酸肽段的氧化变化，发现1407个肽段显著氧化，其中翻译相关因子最为敏感。该研究为理解氧化应激调控翻译机制提供了新见解，方法学创新为氧化还原研究提供了经济高效的技术方案。

　　

在生命科学领域，氧化应激被认为是癌症、神经退行性疾病等病理过程的关键因素，其中蛋白质半胱氨酸(Cys)残基的氧化修饰能显著改变蛋白质结构和功能。然而，目前对特定半胱氨酸氧化如何影响细胞信号通路的认识仍不全面，特别是在前列腺癌等恶性肿瘤中，氧化还原平衡的调控机制亟待阐明。传统氧化还原蛋白质组学方法依赖昂贵的稳定同位素标记或复杂的肽段富集步骤，限制了大规模研究的开展。

针对这些挑战，日本新潟大学医学齿学综合研究科(Graduate School of Medical and Dental Sciences, Niigata University)的研究团队在《Journal of Proteome Research》发表创新性研究。他们开发了基于数据非依赖性采集质谱(DIA-MS)的无标记氧化还原蛋白质组学方法DIALRP，结合单管固相增强样品处理(SP3)技术，系统分析了前列腺癌细胞DU145在甲萘醌(MND)诱导的氧化应激下的半胱氨酸氧化图谱。

研究主要采用四种关键技术：1) 基于DIA-MS的无标记定量策略，使用Q Exactive质谱仪进行数据采集；2) SP3磁珠法高效去除过量烷化试剂；3) 溶剂可及表面积(SASA)计算评估半胱氨酸暴露程度；4) FLAG免疫沉淀质谱(FLAG-IP-MS)分析蛋白质相互作用变化。使用DU145细胞系建立氧化应激模型，通过CellROX和DTNB检测确定50μM MND为最佳处理浓度。

研究结果部分：

"DIALRP揭示DU145细胞对甲萘醌的氧化应激响应特征"显示，该方法成功定量3665个半胱氨酸肽段，氧化修饰百分比的中位数从DMSO处理的24.5%升至MND处理的36.8%。高度氧化的半胱氨酸中59.2%具有二硫键注释，验证了数据的生物学相关性。

"翻译相关蛋白的硫醇基团对甲萘醌最敏感"部分通过基因本体(GO)分析发现，278个高响应蛋白中翻译相关因子最显著富集，包括核糖体蛋白、翻译起始/延伸因子等。SASA分析证实这些半胱氨酸更多暴露于分子表面。

"翻译相关蛋白氧化应激响应的验证"中，AHA标记实验证实MND处理使翻译活性降低67%。Western blot验证了EIF2S2、EIF6等7个翻译因子的氧化响应，且N-乙酰半胱氨酸(NAC)能逆转这种氧化。

"甲萘醌诱导氧化应激下翻译因子的功能验证"通过FLAG-IP-MS发现，MND处理抑制了EIF2复合体(EIF2S1/2/3)形成，促使eIF6核质转位，并导致EEF2形成胞质聚集体。这些变化与相应蛋白半胱氨酸氧化程度高度一致，如EIF2复合体中12/14个半胱氨酸显著氧化。

该研究创新性地建立了简便、经济的氧化还原蛋白质组学方法DIALRP，克服了传统技术对同位素标记或肽段富集的依赖。发现翻译机器是氧化应激的主要靶标，特别是EIF2、eIF6和EEF2等关键因子的半胱氨酸氧化会破坏其复合体形成和亚细胞定位，从而全局调控蛋白质合成。这为理解癌细胞氧化应激适应机制提供了新视角，方法学突破也将推动氧化还原生物学研究的广泛开展。研究还提示，靶向翻译因子的特定半胱氨酸氧化可能成为前列腺癌治疗的新策略。