铜绿假单胞菌跨膜协作机制：III型分泌系统介导的钙离子信号通路驱动胞内病原体逃逸

本研究针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在宿主细胞内形成异质性生态位的机制展开探索。研究人员通过创新性成像技术与定量分析，首次揭示了该病原体通过III型分泌系统(T3SS)介导的钙离子(Ca2+)信号通路，实现胞外菌群对胞内空泡菌群的"救援"现象。研究发现T3SS转位孔蛋白(translocon pore)而非外毒素(exotoxin)是触发Ca2+内流的关键效应因子，这一发现为理解细菌亚群协作的致病机制提供了全新视角，对开发靶向胞内病原体的治疗策略具有重要启示意义。

　　

在微生物与宿主的永恒博弈中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)堪称"变形大师"。这种机会致病菌既能引发烧伤创面感染、角膜溃疡等局部病变，又可导致危及生命的肺部感染。传统观点将其归类为胞外病原体，但越来越多的证据显示其具备惊人的环境适应能力——通过入侵上皮细胞形成胞内生态位。更令人惊讶的是，同一菌群会分化成两个截然不同的亚群：快速增殖的胞质菌(表达III型分泌系统T3SS)和缓慢复制的空泡菌(对抗生素耐受)。这种"双面策略"如何形成？是否存在某种神秘的群体协作机制？这些谜团长期困扰着微生物学家。

美国加州大学伯克利分校的研究团队在《Nature Communications》发表的研究给出了突破性答案。通过开发创新的定量成像分析方法，研究人员首次捕捉到铜绿假单胞菌群体间惊人的跨膜协作现象：胞外菌群通过T3SS转位孔蛋白触发宿主细胞Ca²⁺内流，从而"远程遥控"胞内空泡菌的释放。这一发现不仅改写了人们对细菌致病机制的认知，更为对抗顽固性感染提供了新思路。

研究主要采用四大技术体系：(1)人类角膜上皮细胞(hTCEpi)体外感染模型结合延时荧光显微成像，动态追踪细菌亚群定位；(2)构建系列T3SS突变株(ΔexsE组成型激活株、ΔexsA失活株等)，通过共感染实验解析基因功能；(3)钙离子荧光探针(Fluo-5F AM)实时监测胞内Ca²⁺动态；(4)小鼠角膜划伤感染模型进行活体共聚焦验证。所有实验均设置严格对照，采用定制化ImageJ宏进行定量分析。

关键研究发现

短时感染仅产生空泡菌群

通过优化感染时间窗口，研究发现1小时短时感染后清除胞外菌，细菌仅存在于宿主细胞空泡内且无法自主逃逸。而3小时感染则出现典型的空泡-胞质双生态位，提示胞外菌存在时间依赖性"救援"作用。

空泡释放与细菌数量无关

通过调整感染复数(MOI)证实，空泡菌的命运不取决于初始接种量，而取决于胞外菌的T3SS表达状态。即使将MOI提高至100，短时感染模型中的空泡菌仍保持稳定，颠覆了"数量决定命运"的传统认知。

T3SS组成型表达实现空泡逃逸

利用ΔexsE突变株(T3SS组成型激活)首次证明，T3SS表达强度直接决定空泡释放效率。荧光报告系统显示，3小时感染时T3SS活性较1小时显著增强，为时间依赖性现象提供分子解释。

胞外菌通过T3SS实现跨膜救援

精妙的共感染实验设计(标记不同荧光)揭示：ΔexsE(T3SSON)能救援野生型或ΔexsA(T3SSOFF)菌脱离空泡，且概率计算证实这种协作无需共侵同一细胞，暗示存在可扩散性信号分子。

转位孔蛋白介导Ca²⁺信号通路

机制研究发现ΔpopBD(转位孔缺陷)完全丧失救援能力，而ΔexoS/T/Y(外毒素缺失)仅产生轻微影响。钙离子成像证实T3SSON菌诱导的Ca²⁺内流不依赖宿主钙通道，且药理性激活Ca²⁺信号即可模拟救援效应。

体内验证细菌协作现象

小鼠角膜感染模型显示，仅需10% T3SSON菌即可显著促进90% T3SSOFF菌的组织扩散。活体成像揭示这种协作使细菌突破单个上皮细胞限制，形成更广泛的感染灶。

这项研究从根本上改变了人们对铜绿假单胞菌致病机制的理