工程化线粒体乙酰转移酶诱导的线粒体超乙酰化促进细胞衰老的机制研究

本研究针对线粒体蛋白乙酰化调控机制不明确的科学问题，开发了工程化线粒体乙酰转移酶eMAT，首次实现线粒体蛋白的定向超乙酰化修饰。研究发现eMAT可特异性乙酰化413种线粒体蛋白（74%与已知乙酰化蛋白重叠），通过抑制OXPHOS复合体I/II活性和TCA循环代谢流促进细胞衰老，而SIRT3可逆转这一过程。该研究为理解代谢紊乱与衰老的分子机制提供了新工具和新视角。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其功能异常与衰老和多种疾病密切相关。蛋白质乙酰化是线粒体重要的翻译后修饰（PTM）方式，但长期以来存在一个关键科学问题：线粒体内缺乏明确的乙酰转移酶（HAT），其乙酰化过程被认为主要依赖非酶促反应。这种认知局限使得研究者难以主动操控线粒体乙酰化水平来探究其生理功能。虽然去乙酰化酶SIRT3已被广泛研究，但仅通过抑制SIRT3无法实现线粒体的定向超乙酰化。这种技术瓶颈严重阻碍了人们对线粒体乙酰化在代谢调控和衰老过程中作用的深入理解。

日本理化学研究所（RIKEN Cluster for Pioneering Research）的Tadahiro Shimazu团队在《iScience》发表的研究中，创新性地开发了工程化线粒体乙酰转移酶eMAT（engineered Mitochondrial Acetyltransferase）。该工具通过将p300的HAT结构域与PDHA1的线粒体靶向序列（MTS）融合，成功实现了线粒体基质的特异性定位。研究人员采用蛋白质组学、代谢流分析和细胞衰老模型等多学科技术，包括：1）定量乙酰化蛋白质组学鉴定eMAT靶标；2）Seahorse能量代谢分析系统检测OXPHOS功能；3）SA-βGal染色和SASP因子检测评估细胞衰老表型；4）CRISPR-Cas9构建SIRT3敲除细胞系进行功能验证。

设计并表征工程化线粒体乙酰转移酶

研究团队系统筛选了5种MTS序列与p300催化域的融合蛋白，发现PDHA1_MTS-HAT（即eMAT）在线粒体定位和乙酰化效率上表现最优。通过AlphaFold2预测显示eMAT具有模块化结构：N端MTS、中央p300催化域和C端FLAG标签。免疫荧光和亚细胞分级实验证实eMAT特异性定位于线粒体基质，且其诱导的乙酰化严格依赖催化活性（DY突变体失活）。值得注意的是，eMAT的乙酰化效率显著高于已知线粒体乙酰转移酶GCN5L1和KAT8，且诱导的乙酰化水平是SIRT3敲除细胞的10倍以上。

eMAT特异性催化线粒体乙酰化并抑制细胞增殖

通过多西环素（Dox）诱导系统，研究人员发现eMAT表达量与线粒体乙酰化程度呈剂量依赖性。功能实验显示eMAT通过将细胞阻滞在G1期显著抑制增殖（倍增时间从20h延长至43.4h），而催化失活的eMAT-DY无此效应。蛋白质组学分析鉴定出1,119个乙酰化位点涉及413种蛋白质，其中74%与已知乙酰化蛋白重叠，表明eMAT具有生理相关性。Motif分析显示eMAT没有明显的序列偏好性，是一种广谱线粒体乙酰转移酶。

SIRT3逆转eMAT诱导的线粒体乙酰化并恢复细胞增殖

过表达SIRT3可使eMAT诱导的线粒体乙酰化降低30%，并能部分挽救细胞增殖抑制（高表达eMAT时倍增时间从43.4h恢复至29.2h）。乙酰化蛋白质组学比较发现，在eMAT靶向的564个肽段中，SIRT3能有效逆转其中91个位点的乙酰化。这些共同靶标主要富集于线粒体翻译和能量代谢相关通路，如TCA循环酶（ACO2、DLST）和OXPHOS复合体亚基（NDUFS3、SDHA）。

eMAT乙酰化代谢酶和SOD2调控能量代谢

研究人员验证了12种代谢酶的乙酰化状态，发现eMAT可乙酰化ACO2（K¹⁴⁴、K²⁵⁸）、DLST（K³⁴¹）和SDHA（K¹⁷⁹）等关键酶，且这些修饰均可被SIRT3逆转。特别值得注意的是，抗氧化酶SOD2的K⁶⁸乙酰化水平受eMAT/SIRT3双向调控，这与既往报道的SIRT3-SOD2调控轴一致。代谢分析显示eMAT使TCA循环中间产物普遍降低，同时通过抑制复合体I（降低37%）和复合体II（降低42%）活性显著削弱OXPHOS功能。

eMAT促进hTERT-RPE1细胞衰老

在正常人二倍体hTERT-RPE1细胞中，eMAT诱导的线粒体超乙酰化导致：1）SA-βGal阳性细胞增加3.2倍；2）mtDNA拷贝数下降；3）线粒体ROS水平升高；4）SASP因子（IL1β、IL8）和细胞周期抑制因子（p16、p21）表达上调。这些衰老表型均可被SIRT3部分逆转，证实了SIRT3在抗衰老中的保护作用。

这项研究具有三重重要意义：首先，eMAT作为首个高效线粒体靶向乙酰转移酶，填补了线粒体乙酰化研究的技术空白；其次，揭示了线粒体超乙酰化通过代谢抑制和氧化应激驱动细胞衰老的新机制；最后，阐明了SIRT3通过去乙酰化维持能量代谢稳态的分子基础。这些发现为理解衰老相关疾病（如代谢综合征和神经退行性疾病）提供了新视角，也为开发靶向乙酰化调控的抗衰老策略奠定了理论基础。值得注意的是，研究还提出一个进化生物学观点：生物体可能通过不保留强效线粒体乙酰转移酶来避免持续性超乙酰化带来的代谢风险，而选择发展SIRT3作为保护机制。未来研究可进一步探索eMAT在动物模型中的应用，以及线粒体乙酰化在生理性衰老和病理过程中的动态变化规律。