构象门控机制揭示ATP:钴胺素腺苷转移酶(MMAB)负协同结合AdoCbl的分子基础

本研究针对维生素B12代谢关键酶MMAB的负协同结合机制这一科学难题，通过单分子荧光光谱技术(SRF)首次揭示了AdoCbl与MMAB结合的构象门控机制。研究发现MMAB需经历构象重排(MMABU1→MMABU2)才能结合首个AdoCbl分子，这种动力学不对称性导致第二个AdoCbl结合速率(kf2=0.12 μM-1s-1)显著低于首个(kf1=0.66 μM-1s-1)，从而形成负协同效应(KD2/KD1≈7)。该发现为理解临床突变体D180X的功能缺陷提供了分子机制，对优化辅因子利用策略具有重要指导意义。

　　

在微生物和哺乳动物的代谢网络中，维生素B₁₂(钴胺素)作为稀缺的高价值辅因子，其精确调控机制一直是科学家关注的焦点。其中ATP:钴(I)钴胺素腺苷转移酶(MMAB或ATR)扮演着双重角色：既要催化5'-脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl)的合成，又要确保这个不稳定辅因子高效传递给靶酶。然而长期以来，MMAB表现出的负协同结合现象——即第一个AdoCbl分子的结合会显著降低第二个分子的亲和力(K_D2>K_D1)——其分子机制始终未明。临床研究还发现，D180X突变会导致这种负协同性消失并伴随严重代谢紊乱，但结构基础同样扑朔迷离。

美国康奈尔大学(Cornell University)和休斯顿大学(University of Houston)的研究团队在《Cell Reports Physical Science》发表的研究中，创新性地采用单分子相对荧光光谱(SRF)技术，首次揭示了MMAB通过构象门控机制实现AdoCbl的负协同结合。这项研究不仅阐明了临床突变致病的动力学基础，还为理解细菌在营养限制环境中的适应策略提供了新视角。

研究人员主要运用了以下关键技术：1) 单分子相对荧光光谱(SRF)实时追踪MMAB与AdoCbl结合状态转换；2) 隐马尔可夫模型(ebFRET)分析微观停留时间分布；3) 单分子相互作用模拟(SMIS)验证动力学中间态；4) 位点特异性荧光标记的MMAB变体构建。通过系统比较野生型MMAB与羟基钴胺素(OHCbl)的相互作用，建立了普适性的构象门控模型。

【SRF轨迹可视化MMAB-AdoCbl相互作用】

通过Alexa 555标记的MMAB荧光淬灭效应，研究发现AdoCbl浓度依赖的荧光强度变化可区分未结合(MMAB_U)、单结合(MMAB_S)和双结合(MMAB_D)状态。单分子成像显示，60 μM AdoCbl条件下MMAB_D的中低荧光状态比例符合理论预测的几何构型分布。

【SRF状态揭示MMAB-AdoCbl结合构型】

荧光直方图分解出高(F_H≈1.0)、中(F_M≈0.77)、低(F_L≈0.1)三个状态，对应不同的结合位点组合。特别发现MMAB_D中两个AdoCbl结合最近位点时产生F_L状态，较远位点则表现为F_M状态，这种空间分布为后续动力学分析奠定了基础。

【停留时间分析揭示中间态与动力学模型】

微观停留时间分布τ_HM在低浓度下呈现"上升-衰减"特征，直接证实了MMAB_U1→MMAB_U2构象变化的必要性。而τ_LM的浓度无关性表明AdoCbl解离是典型的单分子过程。通过SMIS模拟验证，最终建立了包含预结合构象变化的四态模型。

【动力学参数定量表征】

全局拟合获得关键参数：首个AdoCbl结合速率(k_f1=0.66 μM^-1s^-1)比第二个(k_f2=0.12 μM^-1s^-1)快5.5倍，而解离速率差异较小(k_r1=3.7 s^-1, k_r2=5.0 s^-1)，证实负协同性主要源于结合速率的不对称性。计算得到的K_D1=5.6 μM与K_D2=41.7 μM比值远超统计学预期(7倍vs 3.3倍)。

【OHCbl验证构象门控普适性】

虽然OHCbl结合表现出更强的荧光淬灭(F_M≈0.4, F_L≈0.05)，但其动力学同样符合构象门控机制。值得注意的是，OHCbl选择的预结合构象(MMAB_U3)与AdoCbl不同(MMAB_U2)，解离常数差异更大(K_D2/K_D1≈13)，说明MMAB能通过构象可塑性适配不同钴胺素衍生物。

这项研究通过单分子技术揭示了MMAB负协同结合的动力学本质：1) 构象门控确保首个AdoCbl快速结合；2) 结合后构象变化抑制第二个位点结合；3) 解离过程保持浓度无关性。这种机制具有重要生理意义：快速捕获稀缺的钴(II)钴胺素并转化为AdoCbl，同时通过负协同性避免双结合状态造成的辅因子浪费。对临床突变体D180X的分析表明，其功能缺陷可能源于构象门控失效导致的k_f1降低。该发现不仅完善了钴胺素代谢调控理论，还为相关代谢疾病治疗提供了新思路，其单分子分析框架也可拓展至核糖开关等调控系统研究。