基于环介导等温扩增技术的废水致泻性大肠杆菌检测方法开发及其在非管网地区的流行病学监测意义

本研究开发了针对致泻性大肠杆菌（EPEC/STEC/EHEC）毒力基因eae和stx2的环介导等温扩增（LAMP）检测体系，创新性整合分子信标（MB）荧光检测与核酸侧向层析（NALF）双模式，在无热循环仪条件下实现102-103拷贝/反应的检测限，为资源受限地区废水监测提供了新型技术方案。

　　

ABSTRACT

致泻性大肠杆菌（Diarrheagenic E. coli）是全球食源性疾病的重要病原体。传统诊断依赖热循环仪（thermocyclers）的PCR技术，在资源受限地区难以推广。本研究开发了两种环介导等温扩增（LAMP）检测模式：基于分子信标（MB）的荧光实时监测和核酸侧向层析（NALF）可视化检测，靶向STEC、EPEC和EHEC的毒力基因eae和stx₂。通过验证非管网地区现场 containment 废水样本，证实该技术可实现10²-10³基因拷贝/反应的检测限，为无管网区域的废水流行病学监测提供新工具。

INTRODUCTION

全球5%-10%人口受食源性疾病影响，其中致泻性大肠杆菌导致的疾病负担最重。EPEC通过基因组肠细胞脱落位点（LEE）编码的黏附素intimin（eae基因产物）定植肠道；STEC产生志贺毒素（stx基因产物）导致结肠细胞坏死；EHEC则是获得stx基因的EPEC变种，引发致命性出血性结肠炎。低收入国家因饮用水安全、医疗资源及污水处理设施不足，成为疾病重灾区。

废水监测在COVID-19疫情期间已证明其流行病学价值，但全球半数人口使用现场containment式卫生设施，传统管网监测无法覆盖。LAMP技术因其等温扩增特性、抗抑制剂能力强，成为理想替代方案。

MATERIALS AND METHODS

引物设计：基于文献优化eae和stx₂的LAMP引物，MB模式在LF引物5′端添加6碱基形成发夹结构，分别标记TAMRA/BHQ-2（eae）和FAM/BHQ-1（stx₂）；NALF模式则用生物素/地高辛标记LF，FAM标记LB。

反应体系：25 μL体系含Bst 3.0 DNA聚合酶、1.4 mM dNTPs和0.8 M甜菜碱，65°C恒温反应。MB-LAMP通过QuantStudio 3实时监测荧光，NALF-LAMP采用HybriDetect 2T试纸条肉眼判读。

样本处理：合成基因片段（10⁶拷贝/μL）作为标准品；从乌干达坎帕拉现场containment采集废水，接种eae阳性/阴性大肠杆菌菌株，经QIAamp试剂盒提取DNA后验证。

RESULTS AND DISCUSSION

MB-LAMP性能：单重检测显示，eae和stx₂在10⁶拷贝/反应时T_t分别为9.8±0.5和13.9±1.2分钟，检测限达500-2000拷贝/反应。双重检测时灵敏度略降，非特异性扩增提前至35分钟出现。废水基质中eae检测保持良好线性（R²=0.74），但stx₂斜率从-8.52降至-4.64。

NALF-LAMP表现：单重模式对10⁵拷贝/反应检出率100%，检测限为数百至数千拷贝。双重模式需三重复均显色才判为阳性，将假阳性率控制在2.7%。废水样本中10⁵-10⁶ CFU/mL接种量可稳定检出，相当于感染者粪便排菌水平。

技术对比：MB-LAMP具备定量潜力但需荧光仪（成本约5万美元），NALF-LAMP成本仅1370美元/次实验，适合现场应用。自引发扩增（self-priming）导致的假阳性仍是挑战，添加支链淀粉（pullulan）或优化温度梯度可能改善特异性。

结论展望

本研究建立的LAMP双模式检测为资源受限地区提供了EPEC/STEC/EHEC监测新工具。未来需结合免疫磁珠富集等技术提升灵敏度，并探索气候变迁对病原体传播的影响机制。该技术对实现SDG6（清洁饮水和卫生设施）目标具有重要实践意义。