利用双物种和三物种FliC嵌合体重建细菌运动能力的机制研究

这篇研究通过构建11种嵌合体FliC（含大肠杆菌K-12核心结构域D0/D1）和截短突变体，系统评估了鞭毛蛋白（flagellin）外域（D2/D3）对细菌运动的影响。研究发现，缺失外域的EE和EEE突变体仍能驱动运动，而含鼠伤寒沙门氏菌D2域的EESS和EESM（含Mesorhizobium sp. D3域）嵌合体能形成功能性鞭毛，但游动速度显著降低（野生型11.2 μm/s vs 嵌合体1.7-3.4 μm/s）。该研究为合成生物学改造鞭毛蛋白提供了关键证据，揭示了外域互换的兼容性边界。

　　

鞭毛蛋白外域的系统进化与结构特征

通过分析210个代表性鞭毛蛋白序列的系统发育树，研究发现外域（D2/D3）的分布具有明显的门类特异性：变形菌门（如大肠杆菌、沙门氏菌）普遍保留外域，而放线菌门和厚壁菌门则完全缺失。值得注意的是，动物来源的鞭毛蛋白中63%含有外域，暗示其在宿主-病原体互作中的潜在作用。AlphaFold3结构预测显示，外域缺失的EE（ΔD2/D3）和EEE（ΔD3）突变体仍能维持核心结构域（D0/D1）的α-螺旋构象，为后续功能研究奠定基础。

嵌合体鞭毛蛋白的理性设计与功能验证

研究团队采用"核心-外域"替换策略，将大肠杆菌K-12 FliC的D0/D1分别与5种细菌（包括Pseudomonas aeruginosa和Helicobacter mustelae）的外域组合，构建了11种嵌合体。游泳平板实验显示，仅含鼠伤寒沙门氏菌D2域的EESS（EE+ST D2）和含Mesorhizobium sp. D3域的EESM（EE+ST D2+MS D3）能形成扩散环（直径9.9-10.6 mm），但显著小于野生型（14.5 mm）。自由游动实验进一步证实，嵌合体菌株的游动速度仅为野生型的15-30%，暗示外域互换可能影响鞭毛超螺旋转换效率。

鞭毛组装与运动性能的分子机制

结晶紫染色揭示了嵌合体鞭毛的形态缺陷：EESS和EESM的鞭毛长度（2.8-3.4 μm）仅为野生型（5.7 μm）的一半。值得注意的是，所有非运动型嵌合体（如含H. mustelae外域的EEH）均未检测到鞭毛丝，表明特定外域（如沙门氏菌D2）可能含有与FliD帽蛋白或FlgK/L钩-丝连接蛋白互作的关键表位。研究还发现，在0.4%琼脂高粘度环境中，嵌合体与野生型的运动能力差异更为显著，提示外域可能通过形成二聚体/四聚体（如Achromobacter的"鞘状结构"）来增强环境适应性。

生物技术应用与未来展望

该研究突破了跨属鞭毛蛋白外域互换的技术瓶颈，为疫苗佐剂（如TLR5激活）和合成生物学工具开发提供了新思路。例如，含沙门氏菌D2域的嵌合体可作为抗原展示平台，而ΔD2/D3的简约设计可能优化工业菌株的运动性能。未来研究需解决外域糖基化（如H. mustelae）对组装的影响，并通过单分子技术解析嵌合体鞭毛的超微结构变化。