共表达S与HE蛋白对重组牛冠状病毒复制的必要性研究及其在疫苗开发中的意义

（编辑推荐）本研究首次建立基于细菌人工染色体(BAC)的牛冠状病毒(BCoV)反向遗传学系统，证实刺突蛋白(S)和血凝素酯酶(HE)共表达是重组病毒回收的关键条件，并发现2.5 μg/mL胰蛋白酶可显著提高病毒滴度至2×104 TCID50/mL。通过构建ZsGreen报告病毒揭示ORF2蛋白在病毒复制晚期的作用，为BCoV致病机制研究和疫苗开发提供新工具。

　　

摘要

研究团队成功利用携带牛冠状病毒(BCoV) Kakegawa株全长基因组的细菌人工染色体(BAC)系统，构建了重组BCoV病毒。通过共表达刺突蛋白(S)和血凝素酯酶(HE)，首次实现重组病毒的稳定回收。实验数据显示，2.5 μg/mL胰蛋白酶可将病毒滴度提升至2×10⁴ TCID₅₀/mL，而ORF2蛋白替换为ZsGreen的报告病毒则揭示了该蛋白在病毒复制晚期可能的功能。

引言

BCoV作为引起牛呼吸道和肠道疾病的重要病原体，其研究长期受限于野外分离株培养困难。尽管与人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)遗传相似，BCoV的反向遗传学研究却严重滞后。本研究通过BAC系统突破技术瓶颈，为解析BCoV复制机制奠定基础。

结果

重组病毒拯救

采用Gibson组装法构建的pBAC-BCoV-Kakegawa-ZsGreen在293T细胞中单独转染时无法产生感染性病毒颗粒。只有当同时转染S蛋白表达质粒(pCAG-BCoV-S-Δ17AA)和带Igk信号肽的HE蛋白表达质粒时，才能在共培养的HRT-18G细胞中回收到ZsGreen阳性病毒。Western blot证实转染细胞中S和HE蛋白的有效表达。

胰蛋白酶的关键作用

使用ZsGreen报告病毒发现，2.5 μg/mL胰蛋白酶使病毒滴度达到峰值，超过该浓度则出现细胞毒性。实时定量PCR显示该浓度下N基因RNA拷贝数显著升高，Northern blot证实重组病毒与野生型具有相同的8种亚基因组RNA表达谱。

ORF2蛋白的功能线索

替换ORF2基因的ZsGreen病毒在感染早期(2天内)与亲本株生长动力学相似，但峰值滴度降低约5倍，提示ORF2可能通过影响病毒组装或释放参与晚期复制。免疫荧光显示ZsGreen信号与N蛋白共定位，但部分N蛋白阳性细胞未检测到ZsGreen，暗示病毒群体可能存在基因丢失。

S-HE蛋白的协同效应

对照实验表明，单独表达S或HE蛋白虽能增强ZsGreen信号，但仅双表达时可产生感染性子代病毒。通过P1代病毒感染实验排除了质粒DNA残留的可能性，证实HE蛋白通过清除细胞表面9-O-乙酰化唾液酸(9-O-Ac-Sia)受体促进病毒释放。

讨论

该研究建立的BAC系统解决了BCoV野外分离株培养滴度低的技术难题。值得注意的是，HE蛋白的酯酶活性可能通过调控病毒受体密度影响出芽效率，这与既往关于HE蛋白在VSV假病毒系统中作用的报道一致。研究者推测S蛋白诱导的细胞融合可能为病毒复制提供更多资源，这一发现为其他难培养冠状病毒的反向遗传学研究提供了新思路。

优化后的培养条件使病毒滴度提升10倍以上，这对疫苗生产具有重要价值。尽管ORF2蛋白的确切功能仍需验证，但其在人类冠状病毒OC43中的同源物ns2已知具有抑制RNaseL通路的功能，暗示其可能在免疫逃逸中发挥作用。

材料与方法

实验使用HRT-18G细胞系进行病毒培养，通过Red/ET同源重组技术构建BAC载体。病毒滴度采用TCID₅₀法测定，使用针对OC43-N蛋白的多克隆抗体进行免疫荧光检测。定量PCR采用特异性引物探针组，可区分基因组RNA和亚基因组N mRNA。

该技术体系不仅为BCoV基础研究提供强大工具，其建立的S-HE共表达策略可能适用于其他难培养冠状病毒，为应对未来人畜共患病威胁储备关键技术。研究揭示的胰蛋白酶浓度优化方案，已显示出直接提升疫苗生产效价的潜力。