猪德尔塔冠状病毒通过组织蛋白酶L和跨膜丝氨酸蛋白酶11E实现不依赖胰蛋白酶的人源细胞感染机制

（编辑推荐）本研究首次揭示猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）通过组织蛋白酶L（CTSL）和跨膜丝氨酸蛋白酶11E（TMPRSS11E）双通路介导内体融合和质膜融合，实现不依赖胰蛋白酶的人源Huh7细胞感染。该发现阐明了PDCoV跨物种传播的分子机制，为冠状病毒防控提供新靶点。

　　

PDCoV在人源细胞中的感染机制解析

PDCoV感染人源细胞不依赖胰蛋白酶

猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）在猪源细胞中依赖外源胰蛋白酶完成感染，但在人源Huh7、HeLa等细胞中无需胰蛋白酶即可高效增殖。通过病毒生长曲线、免疫荧光（IFA）和TCID₅₀实验证实，胰蛋白酶处理对Huh7细胞的病毒RNA拷贝数、滴度及核蛋白（N）表达均无显著影响。连续传代实验显示，PDCoV^T-（无胰蛋白酶制备的病毒）在Huh7细胞中能稳定维持感染性，且胎牛血清（FBS）对胰蛋白酶的灭活作用不影响病毒感染，表明人源细胞存在替代性蛋白酶激活途径。

Huh7细胞培养上清促进病毒感染的奥秘

比较LLC-PK1（猪肾细胞）和Huh7细胞来源的病毒颗粒发现，两者形态学无差异，但人源细胞上清能显著提升PDCoV在猪源细胞中的感染效率。病毒附着和内化实验揭示，Huh7上清中的未知蛋白酶可替代胰蛋白酶功能，促进病毒进入。这一现象暗示人源细胞分泌的蛋白酶可能通过被动迁移或主动切割病毒刺突蛋白（S）发挥作用。

双通路入侵：CTSL与TMPRSS11E的协同作用

通过抑制剂筛选发现，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d和丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF-HCl可分别抑制内体融合和质膜融合途径。联合使用两种抑制剂时，PDCoV感染几乎被完全阻断。进一步实验锁定组织蛋白酶L（CTSL）为内体通路关键酶，其能特异性切割S蛋白的S2亚基，暴露融合肽；而跨膜丝氨酸蛋白酶11E（TMPRSS11E）则介导质膜融合，双荧光报告实验证实其显著增强S蛋白介导的膜融合效率。基因沉默TMPRSS11E后，病毒滴度显著下降，证实其在病毒入侵中的必要性。

Furin调控病毒后期释放

Huh7细胞高表达的furin虽不直接参与病毒入侵，但通过促进S蛋白分泌和病毒颗粒成熟，显著影响PDCoV释放阶段。furin抑制剂处理可降低上清中病毒滴度，但不影响病毒内化，提示其作用集中于病毒组装后环节。

跨物种传播的潜在风险与防控启示

该研究揭示了PDCoV通过CTSL/TMPRSS11E双通路适应人源细胞的分子机制，解释了其跨物种传播潜力。针对这些蛋白酶开发抑制剂，或可成为阻断冠状病毒感染的新策略。研究还提示，不同细胞微环境中蛋白酶表达的差异是决定病毒嗜性的关键因素，为理解冠状病毒的宿主适应性提供了重要依据。