LEF-6磷酸化调控杆状病毒晚期基因转录本的结合与运输机制研究

本研究揭示了杆状病毒AcMNPV中LEF-6蛋白通过磷酸化修饰（尤其是S95位点）特异性结合并转运病毒晚期基因转录本（如p6.9和p10 mRNA）的分子机制。研究发现LEF-6的N端含有RNA结合域（RBD），而C端磷酸化修饰赋予其RNA结合特异性及核质运输功能，显著促进病毒晚期蛋白翻译和感染进程。该成果为优化杆状病毒表达系统（BEVS）提供了新靶点。

　　

LEF-6磷酸化调控杆状病毒晚期基因转录本的结合与运输机制

ABSTRACT

Autographa californica多核多角体病毒（AcMNPV）的LEF-6蛋白被证实能加速病毒感染周期，但其具体功能尚未明确。本研究首次鉴定LEF-6为RNA结合蛋白，优先与病毒晚期转录本（如p6.9和p10 mRNA）相互作用。其N端含有两个典型的核糖核蛋白（RNP）基序，负责RNA结合，而C端则决定RNA结合特异性及病毒感染促进功能。进一步研究发现，LEF-6存在8个磷酸化位点，其中7个位于C端。磷酸化修饰（尤其是关键位点S95）在病毒晚期转录本的结合及胞质运输中起关键作用，表明LEF-6通过识别和核输出病毒晚期mRNA促进蛋白翻译。

INTRODUCTION

杆状病毒为双链DNA病毒，其基因表达受严格时序调控，分为立即早期、早期、晚期和极晚期四个阶段。晚期基因表达依赖病毒早期基因编码的晚期表达因子（LEFs）。LEF-6存在于所有α和β杆状病毒中，虽非病毒复制必需基因，但敲除后会导致晚期转录延迟和病毒产量下降。前期预测显示LEF-6与mRNA输出因子TAP结构相似，且定量磷酸化蛋白质组学发现其在感染期间高度磷酸化，但其功能机制尚不明确。

MATERIALS AND METHODS

研究采用Sf9和High Five细胞系，通过Red/ET重组系统构建LEF-6敲除（KO）、回补（REP）及过表达（OE）的重组病毒。利用荧光各向异性分析、电泳迁移率变动分析（EMSA）和质谱技术，测定LEF-6的RNA结合特性及磷酸化位点。核质分离实验结合qPCR评估病毒mRNA运输效率，AlphaFold2/3预测蛋白质结构及RNA-蛋白相互作用模型。

RESULTS

1. LEF-6促进AcMNPV高效复制

   敲除LEF-6使病毒滴度下降10倍，但DNA复制不受影响。回补LEF-6可恢复病毒复制能力，而过表达未进一步增加滴度，表明其功能存在阈值效应。

2. LEF-6特异性结合病毒晚期RNA

   质谱与RNA-seq显示LEF-6优先结合p6.9和p10 mRNA。EMSA证实其N端（1-90aa）为RNA结合域，但C端（82-173aa）缺失导致结合特异性丧失。

3. 磷酸化调控功能

   鉴定出8个磷酸化位点（Y73、S95、S105等），其中S95突变（S95A）显著降低病毒晚期蛋白表达及mRNA核输出能力，而模拟磷酸化突变（S95E）部分恢复功能。荧光各向异性实验显示，非磷酸化LEF-6对所有RNA亲和力高但无选择性，磷酸化后特异性增强。

4. 结构功能关联

   AlphaFold3预测显示，磷酸化促使C端折叠并与N端RBD协同作用，形成选择性RNA结合口袋。S95突变破坏该构象，导致RNA结合紊乱。

DISCUSSION

LEF-6通过“磷酸化-构象变化-特异性结合”机制，成为杆状病毒晚期基因表达的时空调控枢纽。其作用类似于真核细胞的TAP蛋白，但独特性在于磷酸化依赖的RNA选择性和运输效率。该发现不仅阐明病毒劫持宿主翻译系统的策略，还为优化BEVS的蛋白生产提供了新思路——例如通过修饰LEF-6磷酸化状态增强外源基因表达。未来需探究磷酸化激酶（如病毒PK1）与LEF-6的调控关系，以及其在其他杆状病毒中的保守性。