细胞邻域在肝细胞癌发病机制中的作用

《Annual Review of Pathology-Mechanisms of Disease》：Roles of Cellular Neighborhoods in Hepatocellular Carcinoma Pathogenesis

细胞邻居在肝细胞癌中的研究进展及机制解析

　　肝细胞癌（HCC）的发展涉及肝脏内多种细胞类型之间的复杂相互作用。研究这些细胞间的协调关系，尤其是在不同病因的背景下，对于揭示这种复杂疾病的基本机制至关重要。随着单细胞技术和空间技术的进步，我们对细胞微环境的理解发生了革命性的变化。这些技术帮助我们识别细胞之间的相互作用，以及它们在疾病发生过程中的关键作用。在本文中，我们将探讨与HCC发病机制相关的细胞微环境，包括其在慢性肝病中的变化，以及相关信号通路如何影响这些微环境的形成和功能。此外，我们还将介绍目前用于研究这些细胞微环境的计算方法，并展望未来的研究方向。

### 肝脏的结构与功能

肝脏是一种高度组织化的器官，其基本单位是肝小叶。每个肝小叶由多个层次的肝细胞组成，形成了一个独特的空间结构。来自门静脉和肝动脉的富含氧气和营养的血液进入肝小叶，经过肝窦状毛细血管，最终流入中央静脉。这种代谢物和氧气的定向流动决定了肝细胞的区域特异性功能，使得不同区域的肝细胞表现出不同的代谢特征。此外，肝脏中还存在多种非实质细胞，如库普弗细胞（Kupffer cells）、肝星状细胞（HSCs）等，它们在维持肝脏功能和应对损伤方面发挥着重要作用。库普弗细胞是肝脏中的驻留巨噬细胞，负责肝脏的先天免疫反应。而肝星状细胞则在肝损伤时被激活，参与纤维化和肝硬化的过程。这些细胞之间的协调是维持肝脏健康和应对疾病的关键。

### HCC的发病机制与细胞微环境

HCC的形成与慢性炎症密切相关。不同病因引起的慢性炎症，如乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染、酒精滥用以及代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎（MASH），都可能通过不同的分子机制引发持续的炎症反应，进而导致肝细胞的损伤和病变。例如，HBV感染可能引发T细胞耗竭，形成一个有利于肿瘤形成的免疫抑制环境。而HCV感染则可能通过持续的干扰素（IFN）反应和MDSC（髓源性抑制细胞）的增加，导致NK细胞和T细胞的功能障碍。这些炎症反应不仅影响肝细胞的生存，还可能改变肝脏微环境，促进肿瘤的发生和发展。

在酒精相关的肝病（ALD）中，酒精代谢主要发生在肝小叶的中心区域，导致该区域的肝细胞更容易受到损伤。此外，酒精可能破坏肠道-肝脏屏障，使脂多糖（LPS）等有害物质进入肝脏，从而激活多种免疫细胞，产生促炎性细胞因子，如TNFα、IL-6、IL-1β和IL-8，进一步加剧肝脏损伤。中性粒细胞在ALD中作为初始免疫反应细胞，其在肝脏中的浸润显著增加。研究表明，中性粒细胞外陷阱（NETs）的增加与酒精性肝炎（AH）密切相关，这些NETs不仅能够激活邻近的单核细胞或巨噬细胞，还可能通过持续的炎症反应导致组织损伤。同时，研究还发现，中性粒细胞的缺失可以有效防止酒精诱导的NETs形成，从而减少肝脏损伤，这表明中性粒细胞在肝损伤中的重要作用。

在MASH中，慢性脂肪堆积和炎症是主要特征，其机制涉及脂毒性以及先天免疫系统的激活。MASH中的肝细胞损伤可能由脂质代谢异常和免疫反应的失衡引起。研究发现，MASH中Kupffer细胞的减少可能与脂肪性肝病相关的细胞凋亡有关。同时，Kupffer细胞的身份受损，表现为Trem2和Cd9的表达增强，这些标记物与瘢痕相关巨噬细胞（SAMs）相关。此外，单核细胞来源的巨噬细胞在MASH中被发现可以替代Kupffer细胞的功能。在MASH中，DLL4+CD138+的肝窦内皮细胞（LSECs）可能在引导单核细胞向Kupffer样细胞分化方面发挥关键作用。研究还发现，某些骨髓来源的脂质相关巨噬细胞（LAMs）在代谢功能障碍相关的脂肪肝疾病（MASLD）小鼠模型中显著增加，这些细胞表达的骨桥蛋白（osteopontin）与纤维化的发展密切相关。此外，表达Ccl2和Cd44的成纤维细胞在脂肪堆积区域富集，这些分子可能在招募单核细胞、促进LAMs的形成中起到关键作用。

### 肝细胞死亡与再生

HCC的发病过程中伴随着肝细胞的持续死亡，这种死亡主要以凋亡、坏死或坏死性凋亡的形式出现。凋亡通常被认为是无炎症的，但其也可以通过免疫细胞释放的配体或细胞内毒性条件（如高浓度的活性氧、DNA损伤或复制压力）被激活。相比之下，坏死和坏死性凋亡（一种受控的坏死形式）会释放损伤相关分子模式（DAMPs），引发坏死性炎症。在肝癌中，凋亡和坏死性凋亡相关的细胞微环境可能在肿瘤转化过程中发挥不同的作用。例如，肝细胞的凋亡可能促进HCC的发生，而坏死性凋亡则可能引导转化的肝细胞向胆管癌（CCA）发展。此外，肝细胞在受损后可以重新进入细胞周期，以应对肝脏的再生需求。然而，在慢性肝病中，这种再生过程常常受到抑制，导致肝脏功能的进一步恶化。研究发现，在慢性肝病中，肝细胞再生受损可能与炎症的持续存在有关。通过单细胞和整体转录组分析，研究者发现，严重的酒精性肝炎（sAH）患者表现出最严重的肝区定位紊乱，表现为门区肝细胞的增加和中心区肝细胞的减少。这些变化可能与Wnt信号通路有关，因为Wnt-β-catenin信号在肝脏再生和区域定位中起着关键作用。此外，不同肝病类型在免疫细胞组成上也存在显著差异，尤其是髓源性细胞，这反映了慢性肝病中细胞间复杂互动的多样性。

### 纤维化与肝硬化中的细胞微环境

不同类型的慢性肝病都可能导致纤维化和肝硬化，其中肝细胞的过度死亡和瘢痕组织的积累是关键因素。肝硬化代表了纤维化的晚期阶段，其特征是再生结节被纤维束隔开，这些纤维束连接门区和中心区。虽然肝硬化通常被认为是不可逆的，但纤维化在一定程度上被认为是可逆的。因此，针对纤维化细胞的抑制和免疫系统的调节成为预防肝癌和早期干预的潜在策略。纤维化的启动依赖于损伤的部位和性质，例如，病毒性肝炎主要引起门区炎症，从而导致门区纤维化，而酒精性肝病和MASH则主要影响中心区，导致中心区纤维化。肝星状细胞（HSCs）是介导肝纤维化的关键效应细胞。在静止状态下，HSCs储存视黄醇并维持细胞外基质的平衡。在损伤情况下，HSCs受到多种信号的激活，包括来自中性粒细胞和Th17细胞的IL-17、来自内皮细胞和巨噬细胞的PDGF，以及来自库普弗细胞、单核细胞、淋巴细胞和受损肝细胞的TGFβ。激活后，这些细胞转化为成纤维细胞，导致维生素A储存的减少、α-平滑肌肌动蛋白的上调以及胶原蛋白I的合成。研究表明，HSCs在慢性肝病中会经历亚群的动态变化，从保护HCC转变为促进HCC的形成。此外，单细胞研究还揭示了其他纤维化微环境中的细胞类型，如TREM2+CD9+的SAMs和ACKR1+PLVAP+的内皮细胞，它们在纤维化和肝硬化中的表达具有拓扑特征，并在促进白细胞迁移方面发挥重要作用。

### HCC中的细胞微环境

在HCC的微环境中，细胞的异质性是一个显著特征。单细胞和空间技术的进步使得我们能够更深入地理解肝肿瘤的分子景观。研究发现，肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）之间的互动具有高度的异质性，这为癌症的管理带来了挑战。肿瘤细胞可能通过与免疫细胞的相互作用形成不同的细胞微环境，例如，肿瘤细胞与T细胞、巨噬细胞或三级淋巴结构（TLSs）之间的互动。在HCC中，TLSs作为免疫细胞聚集的区域，其存在与更好的患者预后相关。然而，也有研究指出TLSs可能与较差的预后相关，这表明其在肝癌中的作用尚存争议。TLSs通常由B细胞组成，周围环绕着T细胞，其结构类似于次级淋巴器官。在某些情况下，TLSs可能促进肿瘤细胞的生长和转移，而另一些情况下则可能抑制肿瘤进展。这种异质性提示我们需要更细致地研究TLSs在不同肿瘤类型中的作用。

此外，肿瘤细胞可能通过与邻近肝细胞的互动影响其微环境。例如，肝细胞的凋亡可能促进肿瘤细胞的增殖和存活，而凋亡的肝细胞释放的分子信号可能吸引其他细胞的浸润，形成免疫抑制性微环境。研究表明，肿瘤细胞通过释放特定的细胞因子或信号分子，如CXCL6，可以激活邻近肝细胞的JAK-STAT3通路，进而影响其功能。这些相互作用不仅在HCC中起重要作用，也可能在其他类型的肝癌（如iCCA）中存在类似的机制。

### 影响细胞微环境的关键信号通路

在HCC的微环境中，多种信号通路可能在调控细胞互动方面发挥关键作用。例如，缺氧是一个重要的因素，它可能通过改变细胞的代谢和基因表达模式，影响肿瘤细胞的生存和增殖。缺氧状态下的肿瘤细胞可能通过激活HIF-1α等转录因子，调整其基因表达，以适应低氧环境。同时，缺氧也可能影响免疫细胞的功能，如促进TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）的表达，从而抑制免疫反应。在某些情况下，缺氧可能促进SPP1（分泌磷酸蛋白1）的表达，导致免疫治疗效果下降。因此，理解这些信号通路在HCC中的作用，有助于开发新的治疗策略。

此外，营养和氨基酸的代谢可能在HCC的微环境中起到重要作用。例如，谷氨酰胺是人体中最丰富的氨基酸之一，在肝小叶的中心区域，肝细胞的谷氨酰胺水平最高。这种现象可能与Wnt-β-catenin信号有关，因为该信号调控了谷氨酰胺合成酶（GS）的表达，从而影响谷氨酰胺的合成。在HCC中，肿瘤细胞可能利用类似的机制调节其生长。例如，CTNNB1突变的肿瘤可能通过激活β-catenin信号，利用谷氨酰胺和mTORC1轴来促进肿瘤发展。这提示我们，针对这些信号通路可能成为治疗HCC的新策略。

### 研究细胞微环境的方法

随着单细胞和空间技术的快速发展，我们对细胞微环境的研究也进入了新的阶段。单细胞技术，如10X Genomics和Smart-Seq2，能够揭示单个细胞的基因表达模式，从而帮助我们推断细胞间的相互作用。这些技术通常基于配体-受体对的相互作用，通过计算通信得分来识别可能的细胞微环境。例如，CellphoneDB和CellChat等计算工具能够分析不同细胞类型之间的相互作用，揭示它们在肿瘤微环境中的动态变化。此外，一些方法如Scriabin、NICHES和SPRUCE，能够更精确地分析单个细胞间的相互作用，而不依赖于细胞类型的整体聚合。然而，这些方法仍然面临一些挑战，例如缺乏空间信息，这可能影响对细胞微环境的准确理解。

空间技术，如空间转录组学和空间蛋白质组学，为研究细胞微环境提供了新的视角。空间转录组学技术通常结合测序和成像方法，能够在更高分辨率下分析基因表达的空间分布。例如，10X Visium、Slide-seq和Stereo-seq等技术，能够揭示细胞间的空间关系，从而帮助我们理解它们在微环境中的作用。同时，空间蛋白质组学技术，如CODEX和Molecular Cartography?，能够同时测量多个蛋白质靶点，为研究细胞间的蛋白质相互作用提供了可能。尽管这些技术在分辨率和靶点数量上存在一定的局限性，但它们在揭示细胞微环境的复杂性方面具有重要意义。

### 未来展望

未来的研究将更加关注细胞微环境的分子机制及其对疾病进程的影响。通过更深入的单细胞和空间分析，我们有望揭示不同细胞类型之间的相互作用，并识别出与HCC发病相关的关键信号通路。此外，随着技术的进步，我们期待更多的高通量和高分辨率方法的出现，以更全面地研究这些复杂的细胞微环境。例如，MERFISH、CosMx和Molecular Cartography?等技术已经能够实现更高数量的基因检测和更深入的单细胞分析，这为研究细胞微环境提供了新的可能性。此外，多组学数据的整合也可能成为未来研究的一个重要方向，通过结合不同的数据类型，如单细胞和空间数据，我们可以更全面地理解细胞微环境的形成和功能。

研究HCC的细胞微环境不仅有助于揭示其发病机制，还可能为疾病的早期诊断和治疗提供新的思路。随着对细胞微环境的深入理解，我们或许能够开发出更具针对性的治疗策略，如针对特定细胞类型或信号通路的干预措施。此外，随着计算生物学、免疫学和癌症生物学的交叉融合，我们有望更有效地分析和解释空间数据，从而发现具有生物学意义的细胞微环境。这些研究可能不仅限于HCC，还可能为其他类型的癌症提供借鉴，从而推动癌症研究的整体发展。