毛细管电泳-质谱联用技术在自上而下蛋白质组学中的应用

《Annual Review of Analytical Chemistry》：Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Top-Down Proteomics

顶向下蛋白质组学通过质谱技术分析完整蛋白形式，是揭示蛋白质功能及疾病诊断的重要手段。毛细管电泳-质谱（CE-MS）凭借高分离效率、灵敏度和蛋白复合体维持能力，在复杂生物样本中实现蛋白形式的高通量检测，已应用于癌症代谢组学、单细胞蛋白质组学及纳米医学蛋白衣壳分析，但仍需解决接口稳定性、涂层耐久性及样本处理能力等挑战。

　　质谱（MS）为基础的自上而下蛋白质组学（TDP）技术，旨在深入研究细胞、组织和生物流体（如人类血浆）中蛋白质的多种形式（即蛋白质形式或称蛋白变体，proteoforms），以更全面地理解蛋白质的功能，并发现新的蛋白质生物标志物用于疾病诊断和治疗研发。由于生物样本的复杂性极高，实现高峰容量的蛋白质形式分离变得尤为重要。毛细管电泳（CE）-质谱技术自20世纪80年代以来，因其高效的分离能力和高度的灵敏度，已被广泛认为是蛋白质分析的强大工具。本文将回顾CE-MS在推动TDP中的优势，探讨该方法所面临的挑战与解决方案，并分析CE-MS为基础的TDP在主要研究领域中的潜在贡献，同时展望其未来发展方向。

CE-MS在TDP中展现出多个显著优势。首先，它能够实现高效的、高分辨率的、高峰容量的蛋白质形式分离。与传统的液相色谱（LC）-MS技术相比，CE-MS在分离过程中不依赖固定相，从而减少了样品的扩散和非特异性吸附问题，保证了样品的完整性和高分离效率。例如，研究显示在CE-MS的条件下，某些蛋白质形式可以在理论板数高达数十万的情况下实现分离，这为复杂生物样本中大量蛋白质形式的检测提供了坚实的基础。其次，CE-MS在蛋白质形式检测方面具有极高的灵敏度。尤其是在20世纪90年代，CE-MS已能够检测到亚摩尔级的蛋白质形式，而近年来的进展进一步提升了其对纳米级样品的检测能力。这种高灵敏度使得CE-MS能够用于分析低浓度样品，如整个细胞裂解物甚至单个细胞中的蛋白质形式，为单细胞蛋白质组学的发展提供了可能。

CE-MS还能够与LC技术相结合，形成互补的分离策略，从而显著提升对复杂样本的覆盖范围。例如，通过将LC（如反相液相色谱RPLC）与CE-MS结合，可以实现超高峰容量的蛋白质形式分离，达到数千种蛋白质形式的检测与定量。这种结合不仅提高了分离效率，还为更全面地研究生物系统的蛋白质形式提供了技术支持。此外，CE-MS可以灵活地在变性或天然条件下运行，为研究蛋白质形式之间的非共价相互作用或蛋白质复合物的结构与功能提供了多种可能性。例如，在天然条件下，CE-MS能够直接测量蛋白质复合物的电荷状态和等电点（pI），从而揭示其在生理环境中的行为特征。

在实际应用中，CE-MS在多个领域展现出重要价值。例如，在癌症研究中，CE-MS被用于分析不同癌细胞系的蛋白质形式差异，揭示了蛋白质形式在癌细胞转移过程中的重要变化。通过对非转移性和转移性结直肠癌（CRC）细胞系（如SW480和SW620）的全局定量TDP研究，研究人员发现了多个可能作为癌症转移生物标志物的蛋白质形式。此外，CE-MS还被用于分析植物和真菌中的蛋白质形式，揭示了植物中蛋白质形式的修饰特征，以及其在细胞器定位和功能调控中的作用。在单细胞蛋白质组学领域，CE-MS以其高灵敏度，成功地用于检测少量细胞中的蛋白质形式，为研究细胞间的异质性提供了强有力的技术支持。

同时，CE-MS在天然蛋白质组学（native proteomics）中也表现出独特优势。天然TDP能够直接测量生物体内存在的蛋白质复合物，如碳水化合物结合蛋白、金属结合蛋白以及核糖体等，而无需对蛋白质进行变性处理。这种方法对于研究蛋白质的天然状态及其在生物过程中的作用具有重要意义。此外，CE-MS在抗体类生物药物（如单克隆抗体mAbs和抗体药物偶联物ADCs）的分析中也发挥了重要作用。通过CE-MS，可以精确地分离不同修饰形式的抗体，如电荷变异体（charge variants）或连接药物的ADC，为抗体药物的质量控制和功能研究提供了有效手段。

然而，尽管CE-MS在多个方面展现出巨大潜力，其在实际应用中仍面临一些挑战。例如，CE-MS的接口设计需要考虑电场与电喷雾电离（ESI）之间的相互作用，以避免样品的稀释和信号损失。此外，由于毛细管的样品装载容量有限，对于复杂样本的分析可能需要采用在线样品堆叠技术，如动态pH界面，以提高样品的利用率。另外，毛细管涂层技术的稳定性也是影响CE-MS性能的重要因素，目前仍存在蛋白质非特异性吸附的问题，需要进一步优化涂层材料和工艺。

针对这些挑战，研究者们已经开发出多种改进方案。例如，通过采用无鞘液接口（sheathless interface），可以显著减少样品的稀释，提高检测灵敏度。同时，优化的毛细管设计和电喷雾发射器的改进也使得CE-MS在实际应用中更加稳健和用户友好。此外，动态pH界面的引入为CE-MS提供了更高效的样品装载能力，使得在分析复杂样本时能够保持较高的分离效率和检测灵敏度。而针对毛细管涂层问题，研究者们正在探索新的涂层材料，以减少蛋白质的非特异性吸附并提高分离的稳定性。

展望未来，CE-MS在TDP领域的应用前景广阔。一方面，随着技术的不断进步，CE-MS有望成为实现全球蛋白质形式测量的核心工具，为完成“人类蛋白形式项目”（human proteoform project）提供关键支持。另一方面，CE-MS在单细胞分析、天然蛋白质组学和纳米医学等新兴领域的应用潜力巨大。特别是在纳米医学中，CE-MS能够用于研究纳米颗粒在生物流体中的蛋白质冠（protein corona）组成，这对于理解纳米药物的体内行为和优化其治疗效果具有重要意义。

此外，CE-MS的多功能性使其在不同研究领域中具有广泛的应用价值。例如，在单细胞研究中，CE-MS能够以极低的样品消耗量实现对单个细胞中蛋白质形式的高灵敏度分析，为细胞异质性研究提供了新的视角。在天然蛋白质组学中，CE-MS能够直接分析蛋白质复合物，揭示其在生理条件下的行为特征，从而为研究蛋白质的功能和相互作用提供更真实的模型。而在抗体药物研究中，CE-MS能够精确区分不同修饰形式的抗体，为药物的质量控制和功能研究提供可靠的技术支持。

综上所述，CE-MS在TDP中的应用已经取得了显著进展，但仍需进一步优化其接口设计、样品装载能力和毛细管涂层技术，以提高其在复杂样本分析中的适用性。同时，随着技术的不断成熟，CE-MS将在生物医学研究的多个领域发挥更加重要的作用，为理解疾病机制、发现新的生物标志物和推动药物研发提供强有力的工具支持。未来，CE-MS有望成为蛋白质组学研究的重要组成部分，助力实现更全面、更精准的蛋白质形式分析。