解码人类健康与疾病中的细胞外蛋白质糖基化作用

《Annual Review of Analytical Chemistry》：Decoding Extracellular Protein Glycosylation in Human Health and Disease

糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要形式，涉及N-糖基化和O-糖基化等复杂结构，与疾病发生发展密切相关。本文系统综述了质谱技术、糖结合探针（如凝集素、抗体、纳米抗体等）、化学标签及糖基化工程等前沿方法，包括glycomics/glycoproteomics技术在内，展示了如何通过质谱成像（MALDI-MSI）、纳米抗体技术、点击化学修饰等手段解析糖蛋白结构异质性，揭示肿瘤、神经退行性疾病等中的糖基化标志物。最新进展表明，整合多组学技术的空间糖基组学（如MIBI-TOF）和工程化糖蛋白模拟（如mucin mimetics）为精准诊疗开辟新途径。

　　蛋白糖基化是蛋白质在合成后通过共价键将糖类结构附着到其主链上的重要修饰过程，它广泛存在于所有真核细胞中，并在多种生物分子中发挥关键作用。这一过程具有高度的复杂性和异质性，导致传统的蛋白质表征方法在分析糖蛋白时面临诸多挑战。近年来，随着分析技术的不断进步，科学家们在揭示糖基化结构及其对生物功能影响方面取得了显著进展。这些技术不仅有助于更深入地理解糖基化在人体健康与疾病中的作用，还为疾病诊断、治疗和新药开发提供了新的视角。

### 糖基化的作用与疾病关联

糖基化在多种生理和病理过程中起着至关重要的作用。例如，N-糖基化与蛋白质折叠和稳定性密切相关，而O-糖基化则在细胞粘附、信号传递和保护作用中发挥关键作用。在疾病方面，糖基化异常已被发现与癌症、先天性糖基化障碍、炎症和自身免疫性疾病密切相关。在癌症研究中，糖基化模式的变化不仅反映了肿瘤的进展，还可能作为新的生物标志物或治疗靶点。例如，某些肿瘤相关糖抗原（TACAs）如T抗原和STn抗原，常在癌细胞表面过表达，影响免疫系统的识别与反应。这些糖基化修饰的变化，可以作为早期诊断和疾病监测的重要指标。

此外，糖基化在肿瘤微环境中也扮演了重要角色。一些研究表明，肿瘤细胞通过改变其表面糖基化结构，可以增强其对免疫细胞的抵抗能力。例如，某些癌细胞表面的糖基化修饰会减少其对T细胞的识别，从而促进免疫逃逸。这种机制为开发新的免疫治疗策略提供了理论基础，如通过靶向糖基化修饰的抗体或蛋白来增强免疫系统的攻击能力。

### 分析技术的发展与应用

随着技术的进步，越来越多的先进方法被应用于糖基化的研究。其中，质谱技术（Mass Spectrometry, MS）是目前研究糖基化结构和修饰位置最常用的技术之一。MS不仅可以用于分析释放的糖链，还能用于研究完整的糖蛋白，甚至在空间维度上进行分析，如MALDI-MSI（基质辅助激光解吸电离-质谱成像）。这些方法使得科学家能够更全面地了解糖基化在细胞内的分布及其对细胞功能的影响。

此外，糖基化相关的生物探针和标记技术也在不断发展。例如，利用天然或工程化的糖结合蛋白（如凝集素、抗体-凝集素嵌合体等）来识别特定的糖基化修饰，已经成为一种重要的研究工具。这些探针不仅可以用于检测糖基化修饰的存在，还能用于富集和分离特定的糖基化蛋白，从而进一步分析其功能和作用机制。

### 质谱技术在糖基化研究中的应用

质谱技术在糖基化研究中的应用已经取得了重要突破。N-糖基化和O-糖基化在蛋白质结构和功能中的作用，可以通过不同的质谱策略进行研究。例如，在N-糖基化研究中，科学家可以利用N-糖苷酶释放糖链，并通过质谱分析其结构和修饰位点。而在O-糖基化研究中，O-糖苷酶的使用成为关键，尤其是那些能够特异性切割O-糖基化蛋白质的酶，如O-糖基化蛋白酶（O-glycoproteases）。这些酶能够识别特定的糖基化修饰，并将蛋白质切割成可以进一步分析的片段。

在更先进的质谱技术中，如“原位”质谱（native MS）和“自上而下”质谱（top-down MS），允许科学家在不破坏蛋白质结构的前提下直接分析糖基化修饰。这些技术能够提供更完整的糖基化信息，包括糖链的结构、修饰位点以及糖链对蛋白质整体功能的影响。例如，在研究SARS-CoV-2的刺突蛋白时，科学家利用原位质谱技术发现，不同的糖基化修饰不仅影响蛋白质的折叠和稳定性，还可能影响病毒的感染能力。

与此同时，一些新兴的质谱技术也在不断被开发出来。例如，利用“原位”质谱成像技术，科学家可以研究糖基化在组织中的空间分布。这种方法特别适用于研究糖基化在肿瘤组织、炎症组织以及神经退行性疾病中的变化。例如，在阿尔茨海默病（AD）的研究中，科学家发现，脑组织和血液中的糖基化模式发生了显著变化，这些变化可能与疾病的进展有关。而在结肠癌的研究中，科学家通过分析糖基化修饰的结构，发现某些特定的糖基化形式可能与肿瘤的侵袭性相关。

### 糖基化修饰的可视化与功能研究

除了传统的质谱技术，一些新兴的可视化方法也在糖基化研究中发挥着重要作用。例如，利用扫描隧道显微镜（STM）对糖基化修饰进行可视化，使得科学家能够在分子层面观察糖基化修饰的分布和结构。这种方法能够揭示糖基化修饰在特定蛋白质上的分布模式，如N-糖基化和O-糖基化修饰的异质性。

此外，一些基于抗体的糖基化探针也被开发出来，用于识别特定的糖基化结构。例如，抗糖抗体（antiglycan antibodies）能够特异性识别某些糖基化修饰，如GD2和Globo-H。这些抗体在疾病诊断和治疗方面具有潜在的应用价值，特别是在癌症治疗中，抗糖抗体可以用于靶向治疗，如通过阻断糖基化修饰来增强免疫细胞的攻击能力。

### 糖基化工程与细胞模型的开发

近年来，糖基化工程在细胞模型的开发中取得了重要进展。例如，通过基因编辑技术，科学家可以构建特定糖基化修饰的细胞系，如SimpleCells（SCs），这些细胞系能够模拟某些糖基化异常的状态。通过这种方式，研究人员可以更准确地研究糖基化修饰对细胞功能的影响，如细胞粘附、信号传递和免疫反应。

此外，一些研究还利用了合成糖基化分子（如糖基化多聚物）来模拟天然糖基化结构。这些合成分子可以用于研究糖基化在不同环境下的行为，如细胞膜上的糖基化修饰如何影响细胞的识别和信号传递。例如，通过引入特定的糖基化结构，科学家可以研究这些结构如何影响癌细胞的免疫逃逸能力，或者如何影响细菌与宿主细胞的相互作用。

### 未来展望

随着糖基化研究的深入，越来越多的工具和技术被开发出来，以更好地解析这一复杂的生物过程。这些技术不仅包括质谱分析、糖基化探针、化学标记和细胞模型，还涵盖了多种生物信息学方法，如机器学习和生物数据整合。这些方法的应用，使得糖基化研究能够更全面地揭示其在疾病发生、发展和治疗中的作用。

未来，糖基化研究可能会在多个领域产生深远影响。例如，在癌症治疗中，通过靶向特定的糖基化结构，科学家可以开发新的免疫治疗策略，如利用糖基化修饰的抗体或蛋白来增强免疫系统的攻击能力。在神经退行性疾病中，糖基化模式的变化可能为疾病的早期诊断和干预提供新的思路。此外，糖基化在免疫调节、药物开发和生物材料设计中的应用，也正在不断拓展。

总的来说，糖基化是一个高度复杂且重要的生物过程，它在多种疾病中起着关键作用。随着分析技术的不断进步，科学家能够更精确地研究糖基化修饰的结构、功能和变化，为疾病的诊断和治疗提供新的工具和策略。未来，随着更多研究的深入，糖基化在医学和生物技术中的应用前景将更加广阔。