分子水平超分辨率荧光成像

《Annual Review of Biophysics》：Molecular Level Super-Resolution Fluorescence Imaging

单分子定位显微术（SMLM）通过结合PAINT、MINFLUX等技术突破了传统荧光显微的分辨率限制，实现了接近电子显微镜的分子级分辨率。最新进展包括轴向定位技术（如SAF、MIET、GIET）提升三维成像精度，冷冻荧光显微术克服光漂白问题，扩张显微术（ExM）与SMLM结合增强样本可及性，以及数据分析和校准算法的优化。

　　在过去的三十年中，荧光显微镜技术经历了革命性的进展，特别是在实现分子级分辨率方面。这种技术的突破主要源于一系列创新方法的发展，例如受激辐射耗损（STED）显微镜、光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）。其中，单分子定位显微镜（SMLM）在提高图像分辨率方面表现尤为突出，尽管其速度相较于STED较慢，但通过克服荧光标记的光漂白限制，实现了更高的分辨率。特别值得一提的是DNA点积累用于纳米尺度地形成像（DNA-PAINT）技术，它通过不断更换荧光标记来持续更新信号，从而显著提升了SMLM的性能。此外，低温荧光显微镜（cryo-fluorescence microscopy）以及最近出现的最小光子通量成像（MINFLUX）等先进方法也推动了SMLM向分子级分辨率迈进。

SMLM的核心原理是利用单个荧光分子的定位精度来重构超分辨率图像。传统的荧光显微镜受限于衍射极限，使得其分辨率难以达到纳米级别。然而，SMLM通过控制荧光分子的开关状态和定位信息，使得单个分子的位置可以被精确测定。这种技术的一个显著优势是其技术实现相对简单，只需要一台灵敏的宽场显微镜和相机即可。相比之下，STED显微镜需要复杂的激光系统和高精度的光学元件，因此在实现分子级分辨率方面，SMLM更具可行性。然而，SMLM的缺点在于其速度较慢，因为需要多次成像和定位来构建最终图像，通常需要数千次图像采集才能完成一个高分辨率图像。尽管有一些技术改进，如快速STORM（fSTORM）和STORM的变种，但SMLM在实时成像或活细胞成像方面仍不如STED高效。

DNA-PAINT作为SMLM的一个重要分支，通过可逆的DNA杂交技术实现了对单个分子的连续标记，从而突破了光漂白的限制。该技术在实验中表现出了卓越的性能，特别是在实现亚埃级分辨率方面。RESI（分辨率增强通过顺序成像）是DNA-PAINT的一个变种，通过使用不同的DNA探针序列，可以实现对多个目标的顺序成像和定位，从而提高定位精度。与传统的SMLM相比，RESI能够更高效地利用光子信息，实现更精确的结构解析。MINFLUX则是一种利用结构化激发和检测方案，实现超高精度单分子定位的技术。它通过使用零强度点（如环形光束）来增强定位精度，使得在相同的光子预算下，其定位精度可以比传统宽场SMLM提高一个数量级。MINFLUX不仅在空间分辨率上表现出色，还具备微秒级的时间分辨率，使其在追踪单个分子的动态行为方面具有独特优势。

为了进一步提高SMLM的分辨率，研究人员还开发了多种先进的技术。例如，结构化照明显微镜（SIM）通过使用特定的照明模式，提高了空间分辨率，尽管其提升幅度不如RESI或MINFLUX显著。此外，扩展显微镜（ExM）通过将生物样本嵌入可膨胀的水凝胶中，实现了样本的物理放大，从而让标准显微镜能够观察到纳米尺度的结构。ExM的优势在于其使用广泛且易于操作，使得研究人员能够快速获得高分辨率图像。然而，ExM的局限性在于其分辨率的提升依赖于样本的均匀膨胀，因此需要精确的实验设计和操作。

在实现三维定位方面，研究人员也取得了重要进展。例如，超临界角荧光（SAF）和金属诱导能量转移（MIET）等技术利用了近场效应，实现了纳米级别的轴向定位精度。SAF通过测量荧光分子在玻璃表面的发射角度，确定其距离表面的绝对位置，而MIET则通过金属表面的电子相互作用，实现了更精确的定位。这些技术的出现，使得SMLM在三维空间中能够实现更高的分辨率，为研究复杂的生物结构提供了新的工具。

随着SMLM技术的不断发展，其应用范围也在不断扩大。例如，低温荧光显微镜（cryo-fluorescence microscopy）通过将样本冷却至液氮或液氦温度，显著提高了荧光分子的稳定性，使得单分子定位精度可以达到1 ?。这一技术在研究生物分子的动态行为方面具有巨大潜力，但同时也面临着如何在低温下保持光开关特性的挑战。此外，极化调制激发和极化分辨检测技术为解决光开关不足的问题提供了另一种思路，特别是对于低温SMLM中的双分子共定位研究。

在SMLM的校准和数据分析方面，研究人员也投入了大量精力。DNA折纸结构、蛋白纳米尺和病毒纳米尺等标准工具被广泛用于验证SMLM系统的分辨率和精度。这些工具的结构可以精确控制，使得研究人员能够更可靠地评估他们的实验结果。同时，先进的算法和软件工具，如ThunderSTORM和rapidSTORM，也被用于处理SMLM数据，提高定位精度并减少噪声干扰。此外，基于贝叶斯推理和机器学习的分析方法也逐渐成为SMLM数据处理的重要手段，这些方法能够更准确地解析复杂的荧光信号，并提高定位精度。

未来，随着技术的不断进步，SMLM有望在多个领域发挥更大的作用。例如，在细胞生物学、分子结构分析和生物医学研究中，SMLM的高分辨率和非侵入性特点使其成为研究生物分子动态行为的理想工具。同时，结合多种技术，如RESI、PAINT-MINFLUX和极化低温荧光显微镜，可以进一步提高SMLM的性能，使其在分子尺度上实现更精确的成像。这些技术的发展不仅推动了SMLM的广泛应用，也为理解生命过程的微观机制提供了新的视角。