高原芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)强化发酵改善雪茄烟叶品质的机制与应用研究

本研究通过定向筛选高原芽孢杆菌(Bacillus altitudinis) CCTCC M20211370菌株，系统揭示了其在雪茄烟叶(CTLs)发酵过程中降解含氮化合物（如尼古丁、蛋白质）和促进香气物质（如新植二烯、β-紫罗兰酮）合成的双重功能。通过GC-MS和16S rRNA测序证实，该菌株可重塑微生物群落结构（提升Bacillus/Oceanobacillus丰度），激活类胡萝卜素代谢途径（MEP通路），使醛酮类物质提升13.4%，萜烯类增加64.3%，感官评价显示花香、蜜甜香显著增强。研究为雪茄生物强化发酵提供了理论依据和技术支撑。

　　

1 引言

雪茄烟叶中过量的含氮化合物（蛋白质、生物碱）会降低燃烧性和烟气顺滑度。传统自然发酵存在周期长、风味不稳定等问题，而功能微生物定向调控成为突破方向。高原芽孢杆菌因其突出的蛋白酶活性（577.15 U/mL）和尼古丁降解能力，被选为生物强化剂，旨在同步解决含氮物质转化与香气增强的双重需求。

2 材料与方法

从四川什邡优质雪茄烟叶中分离65株细菌，通过酪蛋白水解圈筛选（D/d值3.955）获得16株产蛋白酶菌株。优选菌株经扫描电镜（10,000×）确认呈杆状（1.2-2.5 μm），16S rDNA测序鉴定为Bacillus altitudinis。设置三组发酵实验：强化组（GD，接种3.82×10⁸ CFU/mL菌液）、空白组（KB，蒸馏水处理）和自然组（ZR）。采用GC-MS分析挥发性物质，Illumina MiSeq测序（V3-V4区）解析微生物群落，感官评价由7位专业评吸员按9分制完成。

3 结果

3.1 菌株特性

该菌株在酪蛋白培养基上形成明显水解圈（水解指数3.955），电镜显示其表面粗糙且呈聚集态生长。系统发育树显示与Bacillus altitudinis标准株100%同源。

3.2 香气物质变化

GD组呈现"三升一降"特征：醛酮类（如癸醛）增加13.4%，萜烯类（新植二烯、α-雪松烯）飙升64.3%，酸类物质显著积累，而烟草生物碱（尼古丁、麦斯明）降低31.6%。新增10种风味物质如芳樟醇、香叶醇等，其中β-紫罗兰酮赋予典型甜香，2Z,6E-法尼醇贡献树脂香。

3.3 微生物群落重构

PCoA分析（PC1=82.87%）显示GD组菌群显著分化：Bacillus相对丰度从12.7%增至41.3%，Oceanobacillus从3.5%升至15.2%，而Rhodococcus从28.4%降至9.1%。真菌群落中Sampaiozyma增加但Aspergillus减少，暗示细菌-真菌跨界互作。

3.4 代谢通路激活

KEGG分析揭示GD组MEP途径关键酶（如EC 2.5.1.1）活性增强，促进异戊二烯焦磷酸（IPP）合成。类胡萝卜素代谢产生β-紫罗兰酮等香气前体，与Sphingomonas等菌属呈强正相关（|ρ|>0.5, p<0.01）。

3.5 感官品质提升

工业级验证（1500 kg批次）显示GD组总分提高17.6%，具体表现为：刺激感降低23%，花香和蜜甜香强度分别增加1.8分和2.1分（5分制），烟气质感更圆润。

4 讨论

该菌株通过三重机制发挥作用：①蛋白酶（如金属内肽酶）降解蛋白质释放氨基酸；②尼古丁脱氢酶减少生物碱；③调控MEP通路增加萜类合成。值得注意的是，虽然真菌群落结构未显著改变，但其乙酰-CoA C-乙酰转移酶等表达量变化，暗示微生物代谢网络的重编程。

5 结论

高原芽孢杆菌通过"降解-重构-转化"的级联反应，实现雪茄烟叶品质的全面提升。未来研究可聚焦其基因组功能模块与代谢通路的精确匹配，推动工业化应用。该成果为特色农产品微生物定向发酵提供了范式。