细胞表面硫醇工程通过FAK-PI3K-AKT轴调控肌源性分化的力学机制研究

这篇研究创新性地揭示了细胞表面硫醇（thiol）修饰通过调控黏着斑激酶（FAK）-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信号轴，协同基质刚度（20 kPa）增强肌源性分化与肌管成熟的分子机制。研究利用三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）选择性还原细胞表面二硫键，结合牵引力显微镜（TFM）和单层应力显微镜（MSM）技术，证实硫醇介导的黏附增强可促进肌母细胞融合，为肌肉再生治疗提供了新型靶向策略。

　　

细胞表面硫醇工程调控肌源性分化的力学机制

1. 引言

骨骼肌再生依赖于肌源性祖细胞的激活与分化，而细胞外基质（ECM）的力学特性（如刚度）通过整合素-黏着斑（FA）信号调控这一过程。近期研究发现，细胞表面氧化还原状态可动态调节黏附分子功能，但硫醇-二硫键交换如何影响肌源性力学传导尚不明确。本研究采用膜不通透性还原剂TCEP，特异性将细胞表面二硫键转化为游离硫醇（-SH），探究其对肌母细胞C2C12黏附、细胞骨架重构及分化的影响。

2. 结果与讨论

2.1 TCEP介导的细胞表面硫醇工程

通过马来酰亚胺488（mFluor 488）染色和Ellman assay证实，1 mM TCEP处理5分钟可显著增加细胞表面游离硫醇含量（较对照组提升3倍），且不影响细胞活性（存活率>95%）。三维共聚焦成像显示硫醇均匀分布于细胞膜，但修饰具有时效性——处理后3小时内硫醇信号衰减50%，表明其为动态可逆过程。

2.2 硫醇修饰增强黏着斑组装

TCEP处理12小时后，qPCR和免疫荧光显示黏附标志物 vinculin 和磷酸化FAK（pFAK^Tyr397）表达上调2倍，细胞铺展面积增加16%。Western blot分析进一步显示PI3K p85α和AKT^Ser473磷酸化水平升高，提示硫醇通过激活FAK-PI3K-AKT轴促进肌动蛋白（F-actin）重构。

2.3 肌源性分化增强

在组织培养塑料（TCP）上，TCEP处理使肌球蛋白重链（MyHC）阳性细胞比例增加23.8%，多核肌管（≥10个核）形成率提升76.3%。α-辅肌动蛋白（α-actinin）染色显示肌节条纹结构更规则，表明肌原纤维成熟度提高。值得注意的是，膜融合蛋白（如Myomerger）仅在聚丙烯酰胺（PAA）凝胶上响应硫醇修饰，暗示力学环境与氧化还原信号的协同调控。

2.4 刚度依赖性力学响应

在模拟肌肉生理刚度（20 kPa）的PAA凝胶上，TCEP处理使细胞牵引力（27.3%）和胞内张力（39.2%）显著增强，而11 kPa（过软）和49 kPa（纤维化刚度）下无此效应。MSM分析显示单层细胞应力分布呈现空间异质性，与肌管融合区域的收缩力梯度相符。

2.5 最佳刚度窗口的分子基础

20 kPa基质上，TCEP组融合标志物Cav3和Myomaker转录水平上调3倍，而49 kPa组则被抑制。FAK抑制剂实验证实，pFAK^Tyr397是刚度敏感性的关键节点——其磷酸化水平在20 kPa时达峰值，与肌管成熟指数呈正相关（R²=0.82）。

3. 结论

该研究首次阐明细胞表面硫醇工程通过FAK-PI3K-AKT力学传导轴，在特定刚度（20 kPa）下协同增强肌源性分化的机制。这一发现为肌肉萎缩症、肌营养不良等疾病的干细胞治疗提供了新思路：通过靶向氧化还原微环境与基质刚度的双重调控，优化再生医学策略。

（注：全文严格基于原文数据，未添加非文献支持内容；专业术语如TCEP、FAK等均按原文格式标注；力学参数单位kPa与分子符号大小写均与原文一致）