拓扑关联域边界破坏对Slc29a3/Unc5b基因座转录调控的组织特异性影响

本研究针对拓扑关联域（TADs）在基因表达调控中的作用展开探索，通过破坏小鼠Slc29a3/Unc5b基因座中保守的CTCF结合位点（CTCF-bs），揭示了TAD边界破坏如何通过重构染色质空间互作导致组织特异性转录变化。研究发现，广泛表达基因间的绝缘边界破坏会引发双向转录调控，其方向与幅度均依赖组织表观遗传背景，挑战了现有增强子劫持（enhancer hijacking）和竞争模型的预测能力，为结构变异的功能解读提供了新视角。

　　

在基因组三维结构研究领域，拓扑关联域（Topologically Associating Domains, TADs）长期被视为基因表达调控的"分子围墙"。传统观点认为，TAD边界通过限制增强子-启动子互作范围维持基因表达稳定性，其破坏可能导致发育基因的异常激活或沉默，进而引发癌症或先天畸形。然而，这种认知主要基于对发育相关基因的研究，对于广泛表达的"看家基因"（housekeeping genes）中TAD边界的功能仍存在巨大知识空白。

俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞学与遗传学研究所（Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences）的Paul Salnikov团队选择了一个独特的研究模型——小鼠Slc29a3/Unc5b基因座。该区域包含两个被强绝缘边界分隔的TAD，分别囊括对生存至关重要的广泛表达基因Slc29a3（编码核苷转运蛋白）和Unc5b（轴突导向受体）。通过系统删除边界处的四个CTCF结合位点，研究人员发现：

关键实验技术包括：1) 多重CRISPR/Cas9结合单链寡核苷酸（ssODN）介导的CTCF位点定向突变；2) 基于UMI（独特分子标识符）的等位特异性靶向RNA测序定量转录变化；3) 捕获Hi-C（cHi-C）解析三维基因组重构；4) 杂交小鼠模型（C57BL/6×CAST）消除转调控干扰；5) 数字PCR验证微细表达差异。

研究结果

生成遗传修饰小鼠

通过优化CRISPR/Cas9结合微同源末端连接（MMEJ）修复策略，成功获得携带2个（Δ2）或4个（Δ4）CTCF-bs缺失的纯合小鼠。ChIP-seq证实突变位点CTC结合完全丧失，且Δ4与Δ2品系的cHi-C图谱显示相似的结构扰动。

CTCF结合位点删除重构局部空间互作

cHi-C揭示：1) 原有TAD边界向Cdh23启动子区迁移，使Slc29a3基因转入Unc5b TAD空间环境；2) 跨边界新型长程互作仅在活跃转录组织中显现（如小脑中新出现的Cdh23基因体与Unc5b远端边界互作）；3) 组织特异性体现在小脑中新互作强度比肝脏高3倍。

空间接触重组导致基因转录改变

UMI辅助靶向RNA-seq发现：1) 肾脏中Slc29a3表达下降40%而Unc5b上升40%，呈现"表达均衡化"；2) 小脑中Slc29a3上调15%伴随Cdh23下降20%，提示增强子劫持与多梳蛋白（Polycomb）介导的异染色质扩散可能共存；3) 肝脏中Psap基因在Δ2品系表达异常但在Δ4品系恢复正常，揭示CTCF簇功能冗余性。

基因组基础模型预测失败

Enformer和AlphaGenome模型预测与实验数据吻合度低（p>0.24），尤其无法捕捉Δ2与Δ4品系间的非线性效应，凸显当前AI模型在解读非编码结构变异中的局限性。

讨论与意义

这项发表于《Epigenetics》的研究颠覆了三个传统认知：首先，TAD边界对广泛表达基因的调控呈现"双向调节器"特性，其破坏可导致激活或抑制取决于组织表观状态；其次，相邻CTCF位点可能承担差异化功能而非简单叠加效应；最重要的是，现有增强子竞争模型仅能解释约35%的观察案例，暗示存在未知的染色质区室化调控机制。

该发现对医学基因组学具有双重启示：一方面为解释CTCF突变相关疾病（如CTCF截断突变导致的智力障碍）的表型异质性提供了新框架；另一方面警示基于深度学习预测非编码变异效应时需谨慎，特别是在涉及结构重排的临床解读中。未来研究需整合单细胞多组学与动态构象分析，以揭示TAD边界在细胞命运决定中的时空调控规律。