综述：CRISPR/Cas技术在胰腺癌研究与治疗中的应用：最新进展与未来展望

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas技术在胰腺癌研究中的革命性应用，涵盖基因编辑（KRASG12D等突变靶向）、肿瘤模型构建（GEMMs/PDX/类器官）及治疗策略开发（如CAR-T联合免疫治疗）。特别强调了该技术在克服化疗耐药（如gemcitabine）、调控肿瘤微环境（TME）及发现新靶点（如USP15/SCAF1）方面的突破性进展，为精准医疗提供新范式。

　　

背景

胰腺导管腺癌（PDAC）作为恶性程度最高的肿瘤之一，其五年生存率不足10%。KRAS、TP53等基因突变与EGFR、Notch等信号通路异常构成其分子特征，而高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）则导致传统治疗（手术/化疗/放疗）效果有限。CRISPR/Cas系统凭借其精准的基因编辑能力，正在重塑胰腺癌研究格局。

CRISPR/Cas系统原理

源自细菌免疫防御机制的CRISPR/Cas9通过sgRNA引导核酸酶靶向切割DNA，依赖PAM序列（如NGG）确保特异性。双链断裂（DSB）后，细胞通过易错的NHEJ或精确的HDR进行修复——前者用于基因敲除（如KRAS^G12D），后者适用于基因校正。衍生技术dCas9通过融合转录抑制域（KRAB）或激活域（VP64）实现基因沉默（CRISPRi）或激活（CRISPRa），而Cas13/CasRx则专攻RNA编辑。新型碱基编辑器（CBE/ABE）和Prime编辑器（PE）进一步实现了无DSB的单碱基修改。

胰腺癌模型构建

CRISPR技术极大简化了基因工程小鼠模型（GEMMs）的创建。通过Pdx1-Cre与LSL-KRAS^G12D系统结合CRISPR敲除Lkb1，可加速胰腺肿瘤发生。更复杂的多基因编辑（如KRAS^G12D+TP53^-/-+SMAD4^-/-）则通过AAV递送实现。类器官模型通过CRISPR敲入KRAS突变并联合CDKN2A等抑癌基因缺失，成功模拟了人类PDAC的异质性。值得注意的是，CRISPR介导的染色体大片段重组（CRISMERE）为研究基因组结构变异提供了新工具。

靶点筛选与机制研究

全基因组CRISPR筛选揭示了多个胰腺癌关键依赖基因：

• 化疗耐药相关：PSMA6缺失增强gemcitabine敏感性，CDK7敲除可逆转紫杉醇耐药

• 代谢调控：ISG15缺失破坏肿瘤干细胞代谢可塑性，PCK1敲除抑制糖异生

• 免疫逃逸：RIPK2敲除增强PD-1疗效，TFAP4缺失恢复CAR-T细胞杀伤效率

• 表观遗传：KDM3A敲除促进T细胞浸润，Ring1b缺失阻止腺泡细胞去分化

治疗应用进展

1. 致癌基因编辑：CasRx特异性沉默KRAS^G12D mRNA抑制肿瘤生长，而Prime编辑器可同时校正12种KRAS突变变体

2. 克服耐药：BRCA1/2基因修复恢复Olaparib敏感性，MUC4敲除逆转gemcitabine耐药

3. 免疫调控：CD40L武装的溶瘤病毒重塑TME，ISG15缺失降低PD-L1表达

4. 非编码区干预：miR-3064敲除抑制转移，HOXA-AS3 CRISPRi阻断miR-29c/CDK6轴

挑战与展望

当前限制包括p53介导的编辑细胞负向选择、AAV载体容量限制及Cas9免疫原性。未来方向聚焦于：

• 新型递送系统（如外泌体装载RNP）

• 高保真编辑器开发（如PE4/PE5）

• 联合治疗策略（免疫检查点抑制剂+CRISPR-edited CAR-T）

• 临床转化推进（NCT05795595等试验）