SlGRF4-GIF1融合基因增强番茄基因型依赖性转化与再生效率的机制研究

本研究针对番茄农杆菌介导遗传转化中存在的基因型依赖性和再生效率低等关键问题，通过系统分析SlGRF家族基因进化关系，验证SlGRF4与SlGIF1互作机制，并首次在番茄中建立RUBY可视化标记系统。研究发现SlGRF4-GIF1融合基因能显著提高三种基因型番茄（AC/YF3/M82）的愈伤组织转化率（最高达84.54%）和芽再生效率（6.88倍），为番茄基因组编辑技术提供了高效转化体系。该成果发表于《Plant Growth Regulation》，为克服作物遗传转化瓶颈提供了新策略。

　　

番茄作为全球重要的经济作物，其遗传改良长期受制于基因型依赖的转化效率差异。传统农杆菌介导的转化方法在AC、M82等易转化品种中成功率较高，但在YF3等顽固基因型中效率骤降至21.6%，严重制约基因功能研究和品种改良。这一瓶颈的核心在于植物内源发育调控网络的复杂性——生长调节因子GRF及其互作因子GIF虽在拟南芥、小麦等物种中被证实可促进再生，但在番茄中的具体作用机制尚未阐明。

华中农业大学园艺作物种质创新与利用全国重点实验室的研究团队通过多学科交叉研究，首次系统解析了番茄SlGRF基因家族进化特征，发现SlGRF4与小麦TaGRF4高度同源且具有典型QLQ/WRC保守域。利用酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)三重验证，证实SlGRF4通过QLQ域与SlGIF1的SNH域形成稳定复合体。研究创新性地引入RUBY可视化报告系统（含酪氨酸酶、细胞色素P450和DOPA双加氧酶融合基因），在Micro-Tom中实现从愈伤组织到果实的全生育期红色标记，克服了传统GUS检测的破坏性和GFP依赖专用设备的局限。

关键技术包括：1) 基于ITAG4.0基因组注释的SlGRF家族生物信息学分析；2) 构建含miR396抗性位点的rGRF4突变体；3) 采用35S启动子驱动GRF4-GIF1融合基因的六种表达载体；4) 对AC/YF3/M82三种基因型开展18次独立转化实验（每次80片子叶外植体）。

Phylogenetic analysis of tomato GRFs

通过邻接法构建包含番茄11个SlGRF、拟南芥9个AtGRF和小麦10个TaGRF的系统发育树，发现SlGRF4与TaGRF4聚在Clade I同一分支。Motif分析显示SlGRF4特有Motif 6，其WRC域含CX₉CX₁₀CX₂H锌指结构，为DNA结合关键区域。启动子分析表明SlGRF4在分生组织高表达，暗示其在再生中的核心作用。

Interaction between SlGRF4 and SlGIF1

Y2H实验证明SlGRF4无论作为诱饵(pGBKT7)或猎物(pGADT7)均可与SlGIF1互作。BiFC显示互作发生在细胞核内，Co-IP进一步验证复合体在体内的稳定性。这为后续功能研究奠定分子基础。

Validation of the RUBY visual reporter system

在Micro-Tom中，转化后15天即可见红色愈伤组织，成熟植株的花和幼果均呈现稳定红色表型。T₁代出现3:1分离比，证实RUBY可作为非破坏性、设备非依赖的优质报告基因。

Genotype-dependent enhancement

在顽固基因型YF3中，GRF4-GIF1使转化率从21.6%提升至84.54%（P<0.01），芽再生效率提高6.88倍。有趣的是，rGRF4在AC中效果最佳（76.93%），但在YF3中无效，说明miR396调控存在基因型特异性。融合蛋白的增效作用可能源于：1) 规避了SlGIF1的核定位障碍；2) 形成功能性转录激活复合体；3) 协同激活细胞周期相关基因。

该研究不仅首次阐明SlGRF4-GIF1模块在番茄再生中的核心作用，更建立了普适性转化体系。特别值得注意的是，GRF4-GIF1在三种基因型中均保持增效稳定性，而单独rGRF4的表现受遗传背景显著影响，这为"通用型"转化元件的设计提供了新思路。研究还揭示miR396可能通过非GRF靶点参与调控，为后续机制探索指明方向。这些发现对实现番茄及其他作物的基因编辑育种具有重要实践价值，相关策略已在小麦、生菜等作物中得到验证性应用。