PEDV通过激活Notch信号通路抑制杯状细胞分化的分子机制及其对肠道黏膜屏障的破坏作用

本研究针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染导致仔猪高死亡率的关键机制，揭示了PEDV通过ORF3蛋白激活Notch信号通路，抑制肠道干细胞(ISCs)向杯状细胞分化，减少黏蛋白MUC2分泌，从而破坏肠道黏膜屏障的分子机制。研究运用肠道类器官模型，首次阐明PEDV-ORF3通过调控Notch/MAPK/Wnt通路影响细胞分化的新机制，为防治PEDV感染提供了新靶点。

　　

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是危害全球养猪业的重要病原体，可导致新生仔猪80%-100%的死亡率。尽管已知PEDV主要侵袭小肠上皮，但其破坏肠道屏障的具体机制尚不清楚。尤其令人困惑的是，病毒感染后肠道杯状细胞数量锐减、黏蛋白分泌障碍的现象，其背后的分子机制一直是研究空白。

中国农业科学院的研究团队通过体内外实验相结合的方式，系统研究了PEDV感染对肠道干细胞分化的影响。研究发现，PEDV感染可导致仔猪小肠绒毛萎缩、隐窝增生，并显著降低紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin的表达。更关键的是，团队首次发现病毒感染会选择性减少杯状细胞数量，抑制黏蛋白MUC2的分泌。

为阐明机制，研究人员采用了三维肠道类器官培养技术，将仔猪小肠隐窝分离培养成具有完整上皮结构的类器官，并进一步建立二维单层培养体系。通过RT-qPCR、Western blot、免疫荧光等技术，发现PEDV感染同时激活Notch和MAPK通路，抑制Wnt/β-catenin通路。其中Notch通路的激活起主导作用，通过上调HES-1、抑制ATOH-1转录因子，阻断肠道干细胞向杯状细胞分化。

研究最关键的突破是鉴定出PEDV的ORF3蛋白是该过程的主要效应分子。ORF3通过增强Notch配体JAG-1/DLL4的表达，激活Notch信号传导，进而抑制杯状细胞分化标志物MUC2、FCGBP和CLCA1的表达。使用Notch抑制剂DAPT处理可逆转这一效应，证实了Notch通路的核心调控作用。

主要技术方法包括：建立仔猪感染模型（n=12）进行时序分析；采用三维肠道类器官培养和二维单层分化系统；运用RT-qPCR检测病毒载量和基因表达；Western blot分析关键蛋白表达；免疫荧光定位细胞类型和蛋白分布；使用Notch通路抑制剂DAPT进行功能回复实验。

【PEDV感染减少仔猪小肠绒毛杯状细胞】部分显示，通过PAS染色和MUC2检测，发现感染后6-24小时杯状细胞数量持续减少，与病毒载量变化趋势一致。绒毛高度/隐窝深度比值显著降低，肠道屏障功能受损。

【PEDV感染调控Notch/MAPK/Wnt通路】部分揭示，感染组Notch-1、JAG-1、DLL4 mRNA表达显著上调，同时伴随ERK1/2磷酸化增强和β-catenin表达抑制。HES-1蛋白水平升高而ATOH-1降低，形成抑制杯状细胞分化的分子环境。

【肠道类器官模型的建立与验证】证实二维单层类器官能模拟体内感染特征，病毒感染后IFN-β、IFN-λ和ISGs表达上调，紧密连接蛋白下调，与体内结果高度一致。

【ORF3激活Notch通路】是研究的核心发现，证明ORF3转染可重现病毒感染对Notch通路的激活效应，且该作用能被DAPT抑制。这不仅解释了病毒感染导致杯状细胞减少的机制，还揭示了ORF3作为病毒致病关键效应分子的新功能。

该研究首次系统阐明了PEDV破坏肠道黏膜屏障的细胞分子机制，发现病毒通过"劫持"宿主Notch通路来抑制杯状细胞分化，这一策略可能帮助病毒逃逸黏液层的物理防御。研究提出的"ORF3-Notch-杯状细胞"调控轴为开发新型抗PEDV药物提供了特异性靶点，Notch抑制剂DAPT的干预效果展示出潜在的临床应用价值。此外，建立的肠道类器官感染模型为研究其他肠道病毒致病机制提供了重要技术平台。