斯洛伐克野生动物中戊型肝炎病毒的分子检测与基因分型研究及其人畜共患风险评估

《Food and Environmental Virology》：Molecular Detection and Genetic Typing of Hepatitis E Virus in Wild Animals from Slovakia

本研究针对斯洛伐克地区野生动物中戊型肝炎病毒（HEV）的流行情况与基因特征展开调查。研究人员通过检测284份野猪及107份野生反刍动物（包括马鹿、狍、欧洲盘羊和黇鹿）的肝与肌肉组织样本，发现野猪肝组织HEV RNA阳性率为14.2%，肌肉组织为10.5%，而所有野生反刍动物样本均为阴性。系统发育分析证实流行的HEV毒株均属人畜共患的HEV-3基因型，并可进一步分为HEV-3a、HEV-3i和HEV-3e亚型。该研究首次证实了HEV-3在斯洛伐克野猪种群中的循环，为评估当地经由野味消费导致的HEV人畜共患风险提供了重要科学依据。

　　

在当今全球公共卫生领域，人畜共患病的威胁日益凸显，其中戊型肝炎（Hepatitis E）因其广泛的分布和潜在的严重健康后果而备受关注。这种疾病由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus, HEV）引起，通常表现为自限性急性肝炎，但在免疫抑制个体或孕妇中可能发展为严重甚至致命的疾病。据世界卫生组织（WHO）估计，全球每年约有2000万例HEV感染，导致约330万有症状的肝炎病例。特别是在欧洲，欧洲疾病预防控制中心（ECDC）在2024年初报告了比利时、捷克和芬兰等国HEV感染病例的异常增加，部分病例与食用生肉或未充分加热的肉制品有关，这再次敲响了食源性传播的警钟。

HEV是一种无包膜（或准包膜）、单股正链RNA病毒，其基因组长度约为6.4-7.2 kb，包含三个开放阅读框：ORF1（编码非结构蛋白）、ORF2（编码病毒衣壳蛋白）和ORF3（编码多功能蛋白）。根据国际病毒分类委员会（ICTV）的最新分类，HEV属于_Hepeviridae科，_{Orthohepevirinae}亚科。其中，_{Paslahepevirus balayani}物种包含了八个基因型（HEV-1至HEV-8）。HEV-1和HEV-2仅感染人类，常在卫生条件较差的发展中国家引起大规模水媒疫情。而HEV-3和HEV-4则是典型的人畜共患基因型，其中HEV-3是发达国家HEV感染的主要元凶。野猪（Sus scrofa）和家猪（Sus scrofa domesticus）被认为是HEV-3的主要储存宿主。然而，HEV-3也在全球多种鹿科动物（如马鹿、狍、黇鹿）中被检测到，这增加了病毒通过野生动物狩猎和消费传播的风险。食用未煮熟的野猪肉、鹿肉或其制品（如香肠、肉酱）已被证实是HEV-3感染人类的重要途径。在斯洛伐克等中欧国家，消费野味是一种常见习俗，这构成了潜在的公共卫生风险。尽管邻国已有关于野生动物中HEV流行的报道，但在斯洛伐克，关于野生动物，特别是野猪和野生反刍动物中HEV的流行情况和遗传特征的系统性研究尚属空白。为了解决这一问题，评估当地HEV的人畜共患风险，研究人员开展了此项研究。

本研究旨在调查斯洛伐克境内为家庭消费而猎杀的野猪和野生反刍动物肝及肌肉组织样本中HEV的存在情况，并对阳性样本进行系统发育分析，以了解当地野生动物中HEV毒株的遗传多样性。研究成果发表在《Food and Environmental Virology》期刊上。

为开展研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：研究团队于2015年至2020年间在斯洛伐克中部和东部的35个狩猎区，共采集了284份野猪样本（246份肝组织，38份肌肉组织）和107份野生反刍动物样本（46份肝组织，61份肌肉组织，物种包括马鹿、狍、欧洲盘羊和黇鹿）。使用TRIzol LS试剂或RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit从组织匀浆中提取总RNA。通过基于TaqMan探针的一步法实时逆转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）筛查样本中的HEV RNA，并以内参基因（beta actin或 GAPDH）作为内部对照以确保检测可靠性。对HEV RNA阳性样本，采用逆转录和巢式PCR（nested PCR）扩增HEV基因组ORF1和ORF2的部分片段。对获得的PCR产物进行Sanger测序，并使用MEGA X软件构建最大似然法（Maximum Likelihood）系统发育树进行基因分型和进化分析。采用卡方检验（chi-square test）比较不同年龄组野猪的HEV阳性率差异。

样本收集与HEV检测

研究人员共分析了284份野猪样本和107份野生反刍动物样本。结果显示，在野猪肝组织样本中，HEV RNA的检出率为14.2%（35/246），在肌肉组织样本中为10.5%（4/38）。按年龄分层分析发现，幼年野猪（<1岁）的肝组织阳性率最高（19.2%），其次是亚成年（1-2岁，13.4%）和成年野猪（>2岁，8.6%），但不同年龄组间的差异无统计学意义（P> 0.05）。值得注意的是，在5对来自同一动物的配对肝、肌肉样本中，有3对样本的两种组织均检测到HEV RNA。与此形成鲜明对比的是，在所有四种野生反刍动物（马鹿、狍、欧洲盘羊和黇鹿）的肝和肌肉组织样本中，均未检测到HEV RNA。HEV阳性样本来自35个被调查狩猎区中的11个，其中在9个同时有野猪和野生反刍动物样本的狩猎区中，有2个区仅野猪检测到HEV，而野生反刍动物为阴性。

系统发育分析与基因分型

为了解流行毒株的遗传特征，研究人员对28个HEV阳性样本的ORF1部分序列（242 bp）和13个样本的ORF2部分序列（304 bp）进行了测序和系统发育分析。所有获得的斯洛伐克野猪HEV序列均属于人畜共患的HEV-3基因型。基于ORF1和ORF2序列构建的系统发育树显示，这些序列根据其地理来源（狩猎区）聚集，来自同一地区的序列具有100%的核苷酸同一性，并形成独立的分支。来自同一动物的肝和肌肉组织序列也显示出100%的核苷酸同一性。更深入的分析表明，这些序列可进一步划分为三个HEV-3亚型：HEV-3a、HEV-3i（属于Group 2）和HEV-3e（属于Group 1），其中HEV-3a亚型是优势亚型。斯洛伐克野猪HEV-3a序列与HEV-3a参考株Meng（AF082843）在ORF1和ORF2片段上的核苷酸同一性分别为88.0–90.1%和90.8–92.1%。HEV-3i序列与参考株BB02（FJ998008）的同一性在ORF1和ORF2上分别为88.0%和90.1%。而HEV-3e序列与参考株swJ8-5（AB248521）的同一性在ORF1和ORF2上分别为89.6%和88.2%。值得注意的是，两个被归类为HEV-3e亚型的序列与斯洛伐克其他野猪HEV-3a和HEV-3i序列的遗传距离较远，核苷酸同一性仅为77.6–80.5%，表明其独特的遗传背景。

讨论与结论

本研究首次在斯洛伐克的野猪种群中证实了人畜共患HEV-3基因型的循环，检出率（肝组织14.2%）与德国等中欧国家的研究结果相近，但低于葡萄牙、意大利等地的报道，这种差异可能与种群密度、生态系统、诊断方法等多种因素有关。年龄分布分析显示，幼年野猪感染率最高，这与克罗地亚、捷克等国的研究一致，但HEV RNA在所有年龄组中均有检出，表明野猪在生命后期乃至成年阶段仍可能感染HEV，这与家猪通常在断奶后早期感染的模式有所不同。

肌肉组织中HEV RNA的检出（10.5%）具有重要的公共卫生意义，它直接提示了通过食用未充分烹饪的野猪肉及其制品传播HEV的风险。在斯洛伐克，消费野味是常见习俗，因此本研究结果对当地公民的健康风险提出了警示。

遗传进化分析揭示了斯洛伐克野猪中HEV-3基因型的遗传多样性，存在HEV-3a、HEV-3i和HEV-3e三个亚型。HEV-3a是优势亚型，其序列与匈牙利野猪毒株高度相似，提示可能存在跨境动物迁移或环境（如水源）传播。更重要的是，部分野猪HEV序列与斯洛伐克本土家猪中发现的序列（如MO17）具有高达94.6%的核苷酸同一性，这强烈暗示了野猪和家猪之间可能存在HEV的相互传播，传播途径可能包括粪便-口途径、环境污染或人员机械携带。

另一方面，在所有 screened 的野生反刍动物样本中均未检测到HEV RNA，这与意大利、克罗地亚和德国圈养鹿群的一些研究结果一致，但与德国、捷克、意大利和匈牙利其他报道在鹿科动物中检出低水平HEV的研究形成对比。这一结果支持了野生反刍动物可能仅是HEV的偶然宿主（spillover host）而非真正储存宿主的观点，其感染可能源于与野猪共享栖息地而发生的偶然暴露。

综上所述，本研究填补了斯洛伐克地区野生动物HEV流行病学数据的空白，首次证实了人畜共患HEV-3基因型在该国野猪种群中的循环，并揭示了其遗传多样性（HEV-3a, -3i, -3e）。研究结果强调了食用未充分加热的野猪肉制品带来的潜在健康风险，并提示了野猪与家猪间病毒传播的可能性。尽管未在野生反刍动物中发现HEV感染证据，但持续的监测对于全面评估人畜共患风险至关重要。这项研究从“One Health”（同一健康）的角度出发，为理解HEV在野生动物、家养动物和人类之间的传播动态提供了关键信息，对制定针对性的公共卫生干预措施和食品安全建议具有重要意义。