调控间充质干细胞分化：3D打印果胶支架的物理化学特性对体外软骨内骨化的精准调控

本研究通过调控3D打印果胶(Pectin)支架的(3-缩水甘油氧丙基)三甲氧基硅烷(GPTMS)交联剂含量和羟基磷灰石(HAp)添加量，构建了具有不同理化特性的支架，用于研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向软骨和肥大软骨的分化。研究发现GPTMS含量增加50%可使压缩模量提高近3倍，而最低GPTMS含量且不含HAp的支架能显著促进软骨标志物(ACAN、Col2A1和SOX9)和肥大标志物(Col10A1、MMP13和RUNX2)的表达，为软骨内骨化(ECO)的体外模拟提供了新策略。

　　

在骨组织工程领域，如何有效模拟软骨内骨化(Endochondral Ossification, ECO)过程一直是个重大挑战。ECO是长骨发育和骨折愈合的关键过程，涉及间充质干细胞先分化为软骨模板，再转化为肥大软骨，最终被骨组织替代的复杂生物学过程。传统骨再生策略主要关注直接骨化(IMO)途径，但越来越多的证据表明，通过ECO途径可能获得更好的骨再生效果。然而，目前缺乏能够精确调控ECO过程的生物材料平台，特别是对软骨和肥大软骨分化阶段具有差异化调控能力的支架材料。

瑞士提契诺州立医院(EOC)再生医学技术实验室的研究团队将目光投向了果胶(Pectin)——这种来源于柑橘皮和苹果渣的可持续生物材料。研究人员创新性地采用(3-缩水甘油氧丙基)三甲氧基硅烷(GPTMS)作为交联剂，通过调整交联程度和添加羟基磷灰石(HAp)，开发了三种具有不同理化特性的3D打印果胶支架，系统研究了其对hBMSCs向软骨和肥大软骨分化的影响。相关成果发表在《Materials》上。

研究采用了多项关键技术：通过挤出式3D打印(EBP)技术制备具有分级孔隙结构的果胶支架；利用衰减全反射红外光谱(ATR-IR)和热重分析(TGA)表征材料化学组成；通过微CT和电子显微镜分析支架形貌；采用单轴压缩测试评估力学性能；使用人原代骨髓间充质干细胞(hBMSCs)进行体外分化实验，通过实时定量PCR(RT-qPCR)、免疫荧光和生化分析评估分化效果。

在"材料制备与表征"部分，研究显示增加GPTMS含量使压缩模量显著提高，Pect1-HAp干态支架的压缩模量达到1.1±0.3 MPa，是Pect1的4倍。有趣的是，水合后所有支架的力学性能都下降，Pect2水合支架表现出最高的压缩模量(174.6±77.3 kPa)。材料表征证实了GPTMS交联网络和HAp的成功引入。

"细胞接种与短期活性"研究表明，纤维蛋白包被显著改善了细胞在支架上的分布和活性。Pect1-HAp在所有时间点都显示出最高的代谢活性。优化后发现7.5×10⁶ cells/mL是最佳接种密度，可实现支架的均匀细胞化。

"软骨形成分化评估"部分显示，Pect1-F支架在2周时表现出最高的糖胺聚糖(GAG)产量(498.34 μg/μg DNA)和软骨标志物(ACAN、Col2A1和SOX9)表达。免疫荧光证实Pect1-F组的II型胶原表达最强。

在"肥大诱导"阶段，令人意外的是，Pect1-F支架同样表现出最高的肥大标志物(Col10A1、MMP13和RUNX2)表达，这表明促进软骨形成阶段的理化特性也有利于后续的肥大分化。

这项研究的重要发现是：较低的支架刚度和不含HAp的组成最有利于ECO过程的两个关键阶段——软骨形成和肥大分化。这与传统观点认为较高刚度和HAp含量促进骨形成有所不同。研究为开发新型骨再生材料提供了重要指导，表明模拟早期软骨阶段ECM特性的材料可能比模仿成熟骨组织的材料更有利于ECO过程。此外，研究建立的体外ECO模型也可用于骨疾病研究和药物筛选，减少动物实验需求。

该研究的创新点在于首次系统研究了果胶支架理化特性对ECO全过程的影响，并发现单一材料组成可同时优化两个关键分化阶段。未来研究可进一步探索材料降解产物对ECO的影响，并引入更多细胞类型(如破骨细胞)以完善ECO模型。这项工作为理解生物材料特性与干细胞命运调控的关系提供了新见解，对骨组织工程和再生医学具有重要价值。