工程化细菌纳米注射器实现多样化生物分子的靶向递送

这篇研究报道了SPEAR（Spike Engineering and Retargeting）技术平台，通过改造光杆状菌毒力盒（PVC）纳米注射系统，实现了核糖核蛋白（RNP）、核酸和蛋白质的模块化靶向递送。该系统利用体外装载和重靶向策略，突破了传统递送工具在细胞类型和分子类别上的限制，为基因治疗和合成生物学提供了高精度、多功能的递送解决方案。

　　

摘要

光杆状菌毒力盒（Photorhabdus virulence cassette, PVC）是一种微生物纳米注射器，可通过工程化改造将蛋白质货物递送至人类细胞。本研究进一步优化该系统，开发了SPEAR（Spike Engineering and Retargeting）技术，实现了体外装载外源货物和靶向分子的功能。SPEAR能够递送多种类型的货物（包括折叠的核糖核蛋白和单链DNA），并在体外和体内靶向特定细胞类型。

主要内容

模块化设计与功能扩展

SPEAR技术通过两个关键附着点实现模块化功能：

1. 货物装载：通过Pvc10与Pvc8的自组装实现体外装载，支持Cas9核糖核蛋白（RNP）和单链DNA（ssDNA）的递送。冷冻电镜显示，Cas9以折叠状态附着于PVC颗粒基部（图1c）。

2. 靶向重编程：通过Pvc13与抗体的共价偶联（如SpyTag/SpyCatcher系统），将单链抗体（scFv）或单克隆抗体（mAb）定向至特定细胞表面受体（如CD3或EGFR）。

技术突破

• 多类型货物共递送：首次实现Cas9 RNP与ssDNA同模板的协同递送，在HEK293FT细胞中同时完成基因切割和同源定向修复（HDR）（图2f）。

• 体外装载灵活性：Δpvc10突变体PVC可通过体外补充Pvc10-Cas9 RNP恢复功能，规避了传统递送工具对细胞代谢活性的依赖（图2b-c）。

• 体内应用验证：靶向小鼠MHC II类分子的PVC在脾脏中特异性清除目标细胞，且未引发显著中和免疫反应（扩展数据图4）。

机制优势

与依赖细胞内吞的递送系统不同，PVC通过类似噬菌体收缩注射系统（CIS）的机械穿刺机制直接穿透细胞膜，避免了内体逃逸瓶颈。AlphaFold3结构预测支持Pvc8/Pvc10与T6SS分泌系统VgrG/PAAR元件的进化同源性（扩展数据图1a），为工程化设计提供了理论依据。

应用前景

SPEAR的模块化特性使其适用于：

1. 基因治疗：如递送碱基编辑器（ZFD）实现无痕编辑（图1g）；

2. 免疫治疗：通过靶向CD3的PVC选择性清除Jurkat细胞（图2i）；

3. 跨物种递送：潜在应用于植物或微生物的遗传改造。

方法学亮点

• 冷冻电镜验证：负染TEM直观显示Cas9在PVC基部的密度分布（图1c）。

• 点击化学装载：HUH内切酶（HUHe）介导的ssDNA共价偶联实现了高精度模板递送（图2d-e）。

• 流式分选验证：混合细胞群（A431/A20）中靶向PVC的杀伤特异性>90%（图2j）。

这项研究为生物医学领域提供了兼具普适性和精确性的递送平台，其技术框架可扩展至其他注射系统（如T6SS或噬菌体），推动合成生物学工具的迭代升级。