基于光谱椭偏技术的SARS-CoV-2 RdRp/Hel序列无标记光学检测平台构建与性能研究

本研究针对新冠病毒核酸检测中高特异性、高灵敏度传感界面的开发需求，设计了一种基于金表面DNA自组装单层膜（SAMs）的光学检测平台。研究人员通过光谱椭偏技术（SE）实时监测SARS-CoV-2 RNA依赖的RNA聚合酶/解旋酶（RdRp/Hel）靶序列的杂交过程，建立差异光谱分析方法，实现单层DNA膜水平（~260 nm紫外吸收特征）的检测灵敏度，获得70±10 nM的解离常数（KD），并证实其对HKU毒株序列的选择性识别能力，为多病毒并行检测提供新思路。

　　

新冠病毒检测领域面临两大核心挑战：如何实现高保守序列的精准识别，以及如何建立无需荧光标记的快速检测方法。传统核酸检测依赖PCR扩增和标记技术，存在操作复杂、成本高等局限。针对这些问题，热那亚大学（Università degli Studi di Genova）的研究团队在《European Biophysics Journal》发表创新成果，开发了一种基于光学原理的无标记检测平台，通过金表面DNA分子自组装与光谱椭偏技术的巧妙结合，实现了对SARS-CoV-2关键保守序列的高效检测。

研究团队采用三步构建法：首先在金基底固定硫醇化探针DNA（HS-p-CoV2），随后插入巯基己醇（MCH）分子间隔层优化界面结构，最后通过靶序列杂交产生光学信号。关键技术包括：1）宽带光谱椭偏仪（245-1700 nm）实时监测分子沉积；2）差异光谱分析增强单分子层信号；3）Langmuir-Hill模型定量分析结合亲和力；4）碱再生技术实现平台重复利用（1 M NaOH处理3分钟）。

SE静态光谱分析

通过δΔ和δψ差异光谱成功捕获DNA特征吸收峰（260 nm），近红外区信号变化与膜厚增加相关。MCH插入引起的光谱偏移反映探针DNA构象重组，杂交后光学厚度进一步增加。

浓度响应特性

在1 nM-5μM浓度范围内建立校准曲线，800 nm处δΔ值与靶浓度呈正相关。拟合获得K_D=(70±10)nM，检测限达16 nM，与文献报道的15-25-mer DNA体系数据一致。

平台选择性验证

静态/动态实验证实：1）可区分10个碱基错配的HKU毒株序列；2）在10倍非靶序列（1μM t-HKU）干扰下，仍能准确识别100 nM靶序列（t-CoV2）。反向实验（HS-p-HKU平台）同样显示对SARS-CoV-2序列的排斥性。

HKU平台构象差异

二级结构预测表明HKU探针更易形成环状结构，导致表面密度降低。SE数据显示HS-p-HKU的δΔ降幅较小而MCH处理后变化更显著，可能与探针空间位阻效应相关。

该研究创新性地将光谱椭偏技术应用于病毒核酸检测，其优势体现在：1）免标记检测避免荧光淬灭问题；2）宽带光谱（UV-NIR）提供多维分子信息；3）可扩展为多靶标并行检测系统。通过RdRp/Hel这一高度保守序列的精准识别，为变异株鉴别提供了新思路。研究揭示的DNA-SAMs界面光学特性（如紫外吸收特征、膜厚变化规律）为后续生物传感器设计提供了重要参考。未来结合原子力显微镜（AFM）纳米光刻技术，有望实现多病毒序列的阵列化检测，在传染病诊断和miRNA检测等领域具有广阔应用前景。