突破缺氧共培养技术瓶颈：新型体外双流室模型实现肠道上皮细胞与严格厌氧菌长期互作研究

研究人员针对肠道宿主-微生物互作研究中缺氧环境维持难题，开发了一种创新型体外双流室模型（DFC），通过在线脱氧单元（AU）实现培养基实时脱氧，成功建立人类肠道上皮细胞与严格厌氧菌（如艰难梭菌C. difficile和脆弱拟杆菌B. fragilis）长达5天的共培养体系。该模型突破传统PDMS芯片的气体渗透限制，为研究肠道感染机制和抗生素（如万古霉素vancomycin）治疗评估提供了重要工具。

　　

人类肠道是一个充满复杂微生物群落的特殊环境，其中超过99%的肠道菌群是严格厌氧菌。这些微生物与宿主上皮细胞的相互作用对维持健康至关重要，但研究这种互作却面临巨大挑战——哺乳动物细胞需要氧气，而厌氧菌在氧气存在下会迅速死亡。传统静态培养模型无法模拟肠道的三维结构和流体剪切力，而动物模型又与人类生理存在差异。尤其对于艰难梭菌感染（CDI）这类重大公共卫生问题，缺乏合适的体外模型严重阻碍了治疗策略的开发。

来自丹麦的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》发表的研究中，创新性地开发了双流室模型（Dual Flow Chamber, DFC）。该系统通过硬质塑料材质避免气体渗透，配合独创的在线脱氧单元（Anaerobization Unit, AU），利用硅胶管液相扩散原理实现培养基快速脱氧（氧含量<1%）。研究人员采用Caco-2肠上皮细胞，在0.3 dyn/cm²的生理剪切力下培养21天，形成具有微绒毛和紧密连接的三维结构。转录组分析显示该模型更接近小肠吸收性肠上皮细胞表型，同时缺氧条件下金属硫蛋白基因表达上调，电子传递链相关基因下调。

关键技术包括：1）硬质塑料DFC与多孔聚酯膜组装技术；2）基于抗氧化剂溶液的在线脱氧系统；3）梯度剪切力培养方案；4）厌氧/需氧双通道独立灌注；5）激光共聚焦显微镜和透射电镜观察细菌-上皮互作。

研究结果揭示：

缺氧肠道微环境建立

通过150 cm硅胶管AU在320 μL/min流速下实现培养基氧含量<0.5%，DFC出口氧浓度稳定维持5天（0.6%降至0.2%）。

肠上皮屏障特性

13天培养的Caco-2细胞层高度达50-140 μm，显著高于静态培养（20 μm），免疫荧光显示紧密连接蛋白Occludin和F-actin完整表达。

转录组特征

与静态培养相比，DFC培养上调组蛋白基因和小分子转运通路，下调纤毛发育相关基因。缺氧条件特异性激活金属硫蛋白基因（如MT1E、MT1X），反映低氧适应。

厌氧菌共培养

成功实现C. difficile和B. fragilis共培养5天， effluent中菌量分别达10⁵ CFU/mL和10⁷ CFU/mL。透射电镜观察到细菌在上皮细胞内外的定植。

万古霉素治疗实验

6 μg/mL万古霉素处理2天使C. difficile effluent菌量下降300倍，但上皮关联菌量仍>10⁴ CFU/cm²。电镜显示抗生素处理后细菌更多存在于细胞内，且与B. fragilis形成聚集态。

这项研究的意义在于突破了现有器官芯片的技术局限：1）首次实现C. difficile在活体肠上皮的长期培养；2）通过模块化设计避免复杂氮气舱的使用；3）为研究抗生素耐药机制提供新模型，如发现万古霉素难以清除上皮内C. difficile的现象。该技术不仅适用于肠道病原体研究，还可拓展到其他严格厌氧微生物与宿主互作的研究领域，为开发针对肠道菌群失调的新型疗法提供了重要平台。