揭示人源表观遗传修饰酶ALKBH5的Fe(II)/2-氧戊二酸依赖性催化机制

本研究通过分子动力学模拟与量子力学/分子力学方法，首次阐明了RNA去甲基化酶ALKBH5的完整催化机制，重点解析了双氧活化、底物氧化及羟化后反应过程。研究发现ALKBH5通过质子转移途径完成hm6A片段化，揭示了第二配位层残基Lys132/Tyr139的关键作用，并发现结构元件NRL1/NRL2的协同运动与催化效率相关。该成果为开发ALKBH5特异性抑制剂提供了理论依据，对癌症等疾病治疗具有重要意义。

　　

在基因表达的精细调控网络中，RNA修饰如同暗藏的密码，其中N⁶-甲基腺苷(m⁶A)是最常见的信使RNA修饰。这种动态可逆的修饰由甲基转移酶"书写"和去甲基酶"擦除"共同调控，而人类仅有的两个m⁶A去甲基酶——ALKBH5和FTO，就成为解码生命过程的关键钥匙。当ALKBH5功能异常时，会引发m⁶A修饰紊乱，与多种癌症的发生发展密切相关。然而，这个重要酶如何精确完成从m⁶A到腺嘌呤的转化？其与同家族的FTO酶有何本质区别？这些关键问题长期困扰着科学家。

美国密歇根理工大学（Michigan Technological University）的研究团队在《Cell Reports Physical Science》发表重要成果。研究人员利用最新获得的ALKBH5-ssRNA复合物晶体结构（PDB ID: 7WKV），通过1微秒级分子动力学模拟追踪酶构象变化，结合量子力学/分子力学(QM/MM)计算，首次完整描绘了ALKBH5的催化蓝图。研究特别关注了双氧活化、底物氧化和羟化后反应三个关键阶段，并创新性地比较了两种可能的hm⁶A分解机制。

关键技术方法包括：1) 基于晶体结构的分子动力学模拟（累计4微秒）；2) QM/MM势能面扫描；3) 动态交叉相关分析(DCCA)揭示构象协同性；4) 能量分解分析(EDA)量化残基贡献；5) 自旋自然轨道(SNO)分析电子转移机制。

【双氧活化机制】

研究发现ALKBH5通过经典的Fe(II)/2OG途径活化氧气：2OG的α-羰基碳首先受到Fe(III)-O-O^-的末端氧（O_d）亲核攻击，经历9.1 kcal/mol能垒形成Fe(II)-过氧琥珀酸中间体（IM1）。随后O-O键异裂产生高活性Fe(IV)=O（IM3），该步骤释放72.1 kcal/mol能量，显著高于同类酶。

【底物氧化动力学】

通过分析5个MD构象发现，m⁶A甲基的氢原子转移(HAT)平均能垒为19.0 kcal/mol，与实验值(20.9 kcal/mol)高度吻合。关键过渡态中Fe-O_p-C呈137.5-160°夹角，证实σ通道电子转移机制。反弹羟化能垒仅2.1 kcal/mol，远低于FTO的9.2 kcal/mol，这解释了ALKBH5的高效性。

【构象协同性】

动态分析揭示：核苷酸识别盖(NRL1/NRL2)与βIV-V环存在特异性协同运动，这种"分子芭蕾"通过Arg130-m⁶A磷酸盐、Phe234-G(-1)的π-π堆积等相互作用，精确维持底物取向。在hm⁶A中间体中，NRL2环柔性显著增加，可能为后续质子转移创造空间。

【羟化后反应抉择】

研究首次证实：相比Schiff碱形成机制（能垒>47 kcal/mol），质子转移途径更合理。该路径中Tyr139通过水分子桥接力传递质子，经24.2 kcal/mol能垒完成hm⁶A分解。第二配位层残基Lys132和Tyr139构成"质子导线"，其重要性已被突变实验验证——Y139A突变体会完全丧失活性。

这项研究不仅阐明了ALKBH5独特的"三步走"催化机制（双氧活化→羟化→质子转移），更揭示了其与FTO的功能分化关键：1) 更低的反弹羟化能垒；2) 特有的质子转移网络；3) NRL2环的动态调控。这些发现为设计ALKBH5特异性抑制剂提供了精准靶点，对开发靶向m⁶A通路的抗癌药物具有重要指导价值。论文揭示的构效关系还可指导酶工程改造，为人工设计核酸修饰酶提供新思路。