底物结构决定p97和RAD23A/B介导的人细胞蛋白酶体降解途径

本研究针对泛素-蛋白酶体系统(UPS)中底物结构如何影响降解途径这一关键问题，通过对比Ub-GFP（折叠良好）和Ub-GFP-tail（含非结构化尾部）两种模型底物，首次在人类细胞中证实底物结构决定其对p97解折叠酶和RAD23A/B转运因子的依赖性。研究发现UBR4-KCMF1复合物介导K29/K48链泛素化，而含非结构化尾部的底物可直接被蛋白酶体识别，为靶向蛋白降解(TPD)策略设计提供了重要理论依据。

　　

在真核细胞中，泛素-蛋白酶体系统(UPS)如同精密运行的"蛋白质回收站"，负责清除错误折叠或损伤的蛋白质。然而，这个系统如何根据底物特性选择不同降解途径，一直是领域内悬而未决的核心问题。东京大学医学科学研究所蛋白质代谢分部的Yi Ding等研究人员在《The Journal of Biochemistry》发表的研究，通过精巧的实验设计揭开了这一谜题。

研究人员采用稳定转染的HCT116细胞系，结合CHX追踪实验、Ub-AQUA/PRM（绝对定量质谱）和DIA-MS（数据非依赖性采集质谱）技术，系统比较了Ub-GFP和Ub-GFP-tail两种底物的降解机制。通过siRNA筛选、免疫共沉淀-质谱联用技术和抑制剂处理实验，揭示了底物结构决定降解途径选择的分子机制。

底物结构决定p97依赖性

研究发现Ub-GFP依赖p97解折叠酶活性，而含65个氨基酸非结构化尾部的Ub-GFP-tail可绕过这一需求。CHX实验显示Ub-GFP半衰期约17分钟，比Ub-GFP-tail（12分钟）更稳定，证实结构特性影响降解效率。

泛素链组成分析

Ub-AQUA/PRM技术定量显示两种底物均以K48（80%）和K29（20%）链为主。值得注意的是，虽然链型相似，但E3连接酶UBR4-KCMF1复合物对两种底物的调控存在差异：在Ub-GFP中该复合物与TRIP12、UBE4B协同作用，而在Ub-GFP-tail中起主导作用。

互作组学揭示机制差异

质谱分析发现Ub-GFP优先结合p97和RAD23B，而Ub-GFP-tail直接富集蛋白酶体亚基。这种互作模式的差异解释了为何含非结构化尾部的底物能绕过辅助因子直接降解。

RAD23A/B的双重功能

RAD23A/B敲除导致Ub-GFP稳定化，但意外发现其通过两种机制影响降解：1）作为转运因子递送底物；2）通过UBA结构域保护泛素链不被去泛素化酶切割。尽管敲除使Ub-GFP-tail的泛素链缩短至三聚体，其降解速率仍保持不变，证实非结构化区域可补偿短链缺陷。

这项研究建立了底物结构-降解途径选择的全新范式：折叠良好的蛋白质需要p97解折叠和RAD23A/B介导的转运，形成"p97-RAD23-蛋白酶体"协同降解轴；而含非结构化区域的底物则通过直接与蛋白酶体相互作用实现"捷径降解"。该发现不仅完善了对UPS通路的理解，更为设计针对不同结构靶点的PROTACs（蛋白降解靶向嵌合体）提供了理论指导——针对含无序区域的靶蛋白可简化降解剂设计，而针对刚性结构靶点则需考虑增强泛素链分支化和辅助因子招募的策略。

研究还提出了p97-proteasome"双向穿梭"的新概念：当底物解折叠不充分时，可返回p97进行再处理，这一发现为理解难降解蛋白（如神经退行性疾病相关蛋白）的清除障碍提供了新视角。由于p97和RAD23在多种癌症中异常表达，该研究为开发选择性调控特定降解途径的抗癌药物开辟了新思路。