基于相位荧光寿命成像与二次谐波成像的肺癌自发荧光定量分析研究

推荐：本研究针对传统H&E染色难以提取定量数据的局限，创新性地采用phasor-FLIM（相位荧光寿命成像）结合SHG（二次谐波）技术，系统分析了非小细胞肺癌（NSCLC）中腺癌（ADC）和鳞癌（SQC）的组织自发荧光特征。研究发现肿瘤微环境中存在显著的弹性蛋白沉积（弹性蛋白变性），并通过光学指纹差异实现了未染色活检样本的精准区域区分，为癌症无标记诊断提供了新策略。

　　

肺癌诊断长期依赖传统的苏木精-伊红（H&E）染色，但这种方法难以提取定量数据，限制了客观生物标志物的开发。组织自发荧光技术通过内源性荧光团（如胶原蛋白、弹性蛋白和NAD(P)H）提供病理学光学特征，为无标记诊断带来希望。然而，如何实现复杂组织微环境的精准解析仍是挑战。

意大利比萨大学仪器共享中心（Center for Instrument Sharing of the University of Pisa, CISUP）的研究团队在《Computational and Structural Biotechnology Journal》发表研究，将相位荧光寿命成像显微镜（phasor-FLIM）与二次谐波（SHG）成像结合，系统分析了非小细胞肺癌（NSCLC）两种亚型——腺癌（ADC）和鳞癌（SQC）的纤维组成特征。研究发现肿瘤组织中存在显著的弹性蛋白沉积（弹性蛋白变性），并通过光学指纹差异实现了未染色活检样本的精准区分，为癌症诊断提供了新思路。

研究采用5例NSCLC患者（2例SQC，3例ADC）的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，通过phasor-FLIM分析750 nm（靶向NAD(P)H）和810 nm（靶向纤维）激发下的自发荧光寿命，结合SHG成像区分胶原蛋白与弹性蛋白。关键技术包括：多光子共聚焦显微镜成像、FastFLIM系统校准、基于SimFCS软件的相位分析，以及弹性蛋白/胶原蛋白指数（ECI）计算。

主要结果

1. 健康与肿瘤组织的自发荧光特征差异

   通过750 nm激发下的DAPI/FITC通道成像，发现肿瘤区域自发荧光强度显著高于健康组织，反映纤维沉积密度差异。

2. SHG相位分析揭示ECM重构

   810 nm激发的SHG信号显示，健康组织中胶原蛋白产生强SHG信号（相位坐标s=0, g=1），而肿瘤组织因弹性蛋白荧光干扰呈现长寿命特征（相位寿命约2.3 ns）。

3. 弹性蛋白变性的定量验证

   通过505/90 nm滤光片捕获的荧光信号与SHG信号空间分离，结合ECI指数计算，证实肿瘤区域弹性蛋白占比显著提升（ECI接近1，健康组织约0）。

4. H&E染色互补验证

   利用H&E染色中嗜伊红对弹性蛋白的特异性增强，荧光显微镜观察到肿瘤区域弹性纤维结构紊乱，与FLIM结果一致。

5. 多组分相位指纹图谱

   相位分析成功区分细胞（寿命中等）、弹性蛋白（长寿命）、脂褐素（短寿命）和红细胞（最短寿命），肿瘤区域细胞呈现更长寿命特征，可能与氧化应激相关。

研究意义

该工作首次通过phasor-FLIM技术揭示了NSCLC中弹性蛋白变性的普遍性，挑战了传统纤维化研究中胶原蛋白主导的认知。方法学上，将SHG的结构信息与FLIM的代谢特征结合，实现了未染色样本的多参数定量分析。临床层面，为ADC和SQC的鉴别诊断提供了新光学标志物，尤其凸显弹性蛋白沉积与腺癌亚型的潜在预后关联。未来结合机器学习算法，有望推动该技术向自动化诊断方向发展。

值得注意的是，肿瘤细胞表现出的长寿命特征（与传统Warburg效应预测相反）可能反映微环境氧化应激状态，而红细胞信号的缺失提示肿瘤区域缺氧特性。这些发现为理解肺癌代谢异质性提供了新视角。研究也指出，福尔马林固定可能影响NAD(P)H荧光特性，未来需在活体活检中进一步验证代谢结论。