基于熔解温度差异的单管EvaGreen实时荧光PCR技术同步检测五种对虾病原体

本研究开发了一种基于EvaGreen染料的五重熔解曲线实时PCR方法，可同步检测白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、十足目虹彩病毒1型(DIV1)、急性肝胰腺坏死病致病性弧菌(VAHPND)和肝肠胞虫(EHP)。该方法灵敏度达101拷贝/μL，临床样本检测显示诊断敏感性(DSe)89.74%-98.91%，诊断特异性(DSp)达100%，为对虾多病原检测提供了高效经济的解决方案。

　　

ABSTRACT

世界动物卫生组织(WOAH)将白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、十足目虹彩病毒1型(DIV1)和急性肝胰腺坏死病(AHPND)列为重要疫病，肝肠胞虫(EHP)作为新发疾病，均严重威胁对虾养殖业。本研究建立的五重EvaGreen熔解曲线实时PCR方法，通过差异熔解温度(Tm)实现了五种病原体的同步检测，其中EHP(73.8-74.0°C)、WSSV(74.8-75.0°C)、V_AHPND(76.7-76.9°C)、IHHNV(78.6-79.0°C)和DIV1(80.0-80.1°C)的Tm值区间互不重叠。

INTRODUCTION

对虾养殖业面临多病原混合感染的严峻挑战。WSSV感染可导致甲壳出现特征性白斑，死亡率高达90%；V_AHPND引发肝胰腺急性坏死；IHHNV造成生长迟缓；DIV1导致体色白化；EHP虽不直接致死但严重抑制生长。传统检测方法效率低下，而基于TaqMan探针的多重PCR成本高昂。

MATERIALS AND METHODS

实验选用五省800份临床样本，针对SWP(孢子壁蛋白)、WSV313、PirB、NS1和MCP(主要衣壳蛋白)基因设计引物。优化后引物浓度分别为EHP 0.52μM、WSSV/IHHNV 0.4μM、V_AHPND/DIV1 0.32μM，退火温度63.3°C。使用TOROGreen HRM预混液，在Bio-RAD CFX96仪上运行40个循环，熔解曲线分析范围68-85°C。

RESULTS

灵敏度测试显示所有病原体检测限均为10¹拷贝/μL，扩增效率94.4%-106.2%。临床样本检测阳性率：EHP 12.5%、DIV1 11.25%、V_AHPND 5.5%、WSSV 5.25%、IHHNV 4.38%。值得注意的是，3%样本存在WSSV+DIV1共感染，0.88%为EHP+IHHNV共感染。与TaqMan法相比，DSe达89.74%-98.91%，DSp均为100%。

DISCUSSION

该方法创新性采用非探针依赖策略，单次检测成本不足1元人民币，较传统方法节约80%成本。熔解曲线分型技术有效解决了多病原检测的交叉反应难题。研究首次报道了中国对虾养殖区WSSV+DIV1的共感染模式，为复杂疾病诊断提供新工具。未来可通过调整引物Tm值区间进一步扩展检测病原谱。

Conclusions

建立的五重EvaGreen实时PCR技术具有操作简便（全程84分钟）、成本低廉、结果可视化等优势，适用于对虾养殖场的病原监测和疫情预警，为水产病害防控提供了革命性技术手段。