SARS-CoV-2基因组测序技术对决：牛津纳米孔Clear DX与Illumina平台的直接比较与临床意义

这篇研究通过直接比较牛津纳米孔Clear DX（ONTDX）与Illumina（NextSeq 550/2000）平台对1,513例SARS-CoV-2阳性呼吸道样本的测序性能，发现两者在基因组覆盖度（>90%覆盖率分别达98.9%和98.6%）和谱系分型（2.5%亚型差异）上高度一致，但ONTDX在ORF1ab基因覆盖（99.1% vs 97.8%，P=2.2×10?16）和自动化分析方面略优。研究强调了不同平台间系统误差对进化树分析的潜在影响，为疫情监测技术选择提供了关键数据支撑。

　　

ABSTRACT

研究团队对1,513例SARS-CoV-2阳性呼吸道样本进行平行测序，采用牛津纳米孔Clear DX（ONTDX）与Illumina NextSeq 550/2000平台。通过统一生物信息学流程分析FASTQ数据，发现两种平台在共识基因组生成上无显著差异，但ONTDX展现出更优的覆盖性能（98.5% vs 97.6%）。值得注意的是，2.5%样本因测序方法差异被分配至不同亚型，2例甚至出现分支级别差异。样本在-80°C储存594-970天后仍能获得>91.5%的高覆盖率基因组，证实了病毒RNA的长期稳定性。

INTRODUCTION

自1965年DNA测序技术诞生以来，高通量测序（NGS）在病毒诊断和分子流行病学中发挥关键作用。COVID-19大流行期间，78%的GISAID数据源自Illumina，13%来自牛津纳米孔技术（ONT）。既往研究认为Illumina准确性更高，但ONT具有长读长、实时测序和低成本优势。本研究通过VA SeqCURE网络，首次大规模比较自动化ONTDX系统与Illumina平台在临床样本中的表现。

MATERIALS AND METHODS

样本选择2020年3月至2021年3月Ct值<28的阳性呼吸道标本，RNA经MagMax提取后等分。ONTDX使用Midnight v2/v3引物，Illumina采用ARTIC V4引物。分析分为两种策略：Comparison 1采用统一最小覆盖深度（Study A 20×，Study B 30×），Comparison 2采用平台默认流程。使用Pangolin 4.3.1和Nextclade v2.14.1进行谱系分型，Genome Detective计算基因覆盖度。

RESULTS

Study design overview

Study A（1,017样本）显示ONTDX与NextSeq 550的中位测序间隔为189天，平均覆盖率98.5% vs 97.6%。Study B（496样本）中ONTDX覆盖率92.9%，优于Illumina的91.2%。平台默认分析时，NextSeq 2000表现最差（86.2% vs ONTDX 93.2%）。

Harmonized analytic comparison

Nextclade质量评分显示95.8% ONTDX和94.7% Illumina序列为"Good"级。ORF1ab基因覆盖差异最显著（ONTDX 99.1% vs Illumina 97.8%，P<0.001），导致6例样本被分别标注为B.1.369和B.1.564谱系——这源于Pangolin哈希表匹配机制对模糊碱基的敏感性差异。

Platform default analytic comparison

"真实世界"分析中，ONTDX与NextSeq 550的>90%覆盖率样本比例相当（97.8% vs 98.1%），但与NextSeq 2000比较时出现8例谱系分型差异。特别值得注意的是样本998162，在两种平台分别被归入20A和20C进化分支。

DISCUSSION

与使用GridION的既往研究不同，本研究发现自动化ONTDX系统在覆盖完整性上略优于Illumina。2.5%的亚型分型差异警示公共数据库比对时需考虑平台偏倚。研究同时验证了ONT平台在自动化、长读长方面的优势，其单次运行23分钟/样本的速度适合大规模监测。样本存储长达970天仍获高质量数据，为回顾性研究提供保障。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢爱荷华城、坦佩和博伊西VA医疗中心团队支持，本研究由VA SeqCURE合同（BX000207等）资助。